多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油生产乙偶姻

杨 晗，纪晓俊，聂志奎，黄 和

(南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009)

乙偶姻，又名3-羟基丁酮、双乙酰或甲基乙酰甲醇，是一种重要的食用香料。此外，作为一种平台化合物，乙偶姻亦广泛应用于功能材料、医药生产和化学合成等领域［1］，是美国能源部2004年提出的优先开发的30种生物基平台化合物之一［2］。生产乙偶姻的传统方法主要是通过化学方法，包括丁二酮部分加氢还原法、2，3-丁二醇选择性氧化法和丁酮氯化水解法。这些方法所生产出的乙偶姻产量和得率较低，质量也难以达到食品级要求［3］。更重要的是，其生产原料多来自石油产品，使得其成本高且污染严重［3］。生物法生产乙偶姻因其环境友好、能耗低、污染小等优点，近年来受到了越来越广泛的关注［4－5］。现今，生物法生产乙偶姻的菌种包括肺炎克雷伯氏菌［6－7］、芽胞杆菌［8－9］和产气肠杆菌［10］。然而，生物法生产乙偶姻至今未实现规模化生产，主要原因有:乙偶姻的产量低，多使用葡萄糖作为原料，原料成本高，使用的微生物对环境有潜在的风险。所以，寻找一种安全、有效、能够利用廉价原料生产乙偶姻的微生物成为解决乙偶姻生物法生产的关键问题。

随着对生物柴油研究的深入和生物柴油的大量生产，其副产物粗甘油的产量也迅速增加，平均每生产 1 t生物柴油就产生 100 kg粗甘油［11－12］。这些粗甘油废液如果不能及时有效地利用和处理，将可能成为新的污染源。利用粗甘油生物合成乙偶姻，不仅可以解决粗甘油的高效利用，而且可以降低乙偶姻的生产成本。

因此，本文中笔者研究多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油来生产乙偶姻，并研究其生产工艺，以期为规模化生产乙偶姻提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌株

多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)AE-308，笔者所在实验室保藏。

1.2 生物柴油副产物粗甘油预处理

本文中使用的生物柴油副产物粗甘油由中国石化抚顺石油化工研究院提供，已经过脱色、脱盐处理。主要成分包括甘油(体积分数88.3%)、甘油三酯(体积分数10%)和少量的水，经发酵测试，其产物生成能力与同浓度的纯甘油相似(数据未列出)。所以仅对其进行抽滤以去除其中的固体杂质，然后直接用于发酵。

1.3 培养条件

平板培养基(g/L):粗甘油10、蛋白胨5、酵母膏4。

活化培养基(g/L):粗甘油15、蛋白胨10、酵母膏4。

发酵罐接种种子液培养基(g/L):粗甘油60、蛋白胨10、酵母膏7。

发酵培养基(g/L):粗甘油60、蛋白胨10、酵母膏 7、K2HPO4·3H2O 4、KH2PO41.5、NH4Cl 1、(NH4)2HPO40.5;微量离子(mg/L)MgSO4·7H2O 219、FeSO4·7H2O 44、CaCl2·2H2O 8.8、ZnSO4·7H2O 0.9、MnSO4·H2O 0.9。微量离子溶液浓缩1 000倍，配制后分3部分进行灭菌:Mg2+、Mn2+、Zn2+(直接灭菌);Ca2+、Fe2+采用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，装入5 mL离心管，放入4℃冰柜中待用;其余无机盐溶液母液配制完成之后放入4℃冰柜中待用［13］。

种子活化方法:将平板中保存的单菌落接种至装有100 mL活化培养基的三角烧瓶(250 mL)中，在转速为200 r/min的台式恒温摇床中31℃培养24 h。

种子液培养方法:将活化液按接种量10%接入装有100 mL种子液培养基的三角烧瓶(250 mL)中，在转速为200 r/min的台式恒温摇床中31℃培养48 h。

1.4 分析方法

1.4.1 甘油的快速滴定法检测

为了实时测定发酵过程中发酵液的甘油浓度，采用滴定法测定发酵液中的甘油。从发酵罐中取10～15 mL发酵液于12 000 r/min下离心5 min，用移液管准确移1 mL上清液置于250 mL的三角瓶中，加水10 mL，加入酚酞指示，0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至变色。然后加入10 mL 0.1 mol/L高碘酸钠溶液，避光反应5 min，再加入乙二醇(体积分数25%)溶液5 mL，避光反应5 min。然后用上述NaOH标准溶液滴定至变色，记录所用NaOH溶液的量。甘油质量浓度由式(1)进行计算。

式中:c为NaOH标准溶液浓度(mol/L)，V1是消耗的NaOH标准溶液体积(mL)，V2为取液量(mL)。

1.4.2 菌体干质量的测定

菌体干质量通过吸光值换算求得。取发酵液，用紫外分光光度计测量出540 nm处的OD540，根据以下公式换算成细胞干质量(DCW):

1.4.3 发酵产物的测定

待测试样的制备:取发酵液于12 000 r/min下离心5 min，取1 mL上清液，稀释10倍，用0.22 μm微孔滤膜过滤备用。

检测仪器为DIONEX Summit高效液相色谱仪(CHROMELEON色谱工作站，P680A低压四元梯度泵，SHODEX RI-101示差折光检测器，CBL Model 100柱温箱，ASI-100自动进样器)，Aminex HPX-87H色谱柱(美国Bio-Rad公司)。检测条件:正接色谱柱，柱温65℃;流动相为0.005 mol/L H2SO4，流速为 0.6 mL/min［14］。

2 结果与讨论

2.1 pH对产物生成的影响

2.1.1 初始pH对产物生成的影响

选择初始pH分别为5、6、7和8，初始甘油质量浓度(以粗甘油计)60 g/L，在发酵罐中进行批次发酵，发酵过程中pH自然变化，不再添加任何物质。实验结果如表1所示。由表1可知:底物最终都未耗尽，而且残留甘油质量浓度都在15 g/L左右。pH分别为5、6、7和8时，乙偶姻在总产物中的比例分别为62%、62%、48%和53%，在2，3-丁二醇和乙偶姻中的比例分别为76%、77%、61%和66%，乙偶姻与 2，3-丁二醇的总产量分别为 17.61、18.4、17.72和17.1 g/L。可以看出，随着初始pH的升高，乙偶姻在产物中的比例逐渐下降，但在pH达到7后，比例变化不明显;且就总产量和转化率而言，无论选择哪一种初始pH，对最终结果都影响不大，仅初始pH为6时产量稍高，但是就产物间比例的变化看来，pH是影响发酵过程的重要因素，所以，笔者继续尝试对发酵过程中的pH控制进行考察。

表1 初始pH对P.polymyxa AE-308发酵产乙偶姻的影响Table 1 Effects of initial pH value on acetoin fermentation by P.polymyxa AE-308 g·L －1

2.1.2 不同恒定pH对产物生成的影响

调节发酵液初始pH为6，初始甘油质量浓度(以粗甘油计)60 g/L，在发酵罐中进行批次发酵。通过分别流加NaOH或H2SO4控制反应中的pH恒为6、7和8，实验结果如图1所示。由图1可知:与不控制发酵pH不同的是，在pH恒定的情况下，底物都被完全消耗。在pH恒为6时，在120 h内甘油的平均消耗速率为0.43 g/(L·h)，生产强度(乙偶姻+2，3-丁二醇)为0.175 g/(L·h);pH 恒为7时，120 h内甘油的平均消耗速率为0.44 g/(L·h)，生产强度为0.128 g/L;pH恒为8时，117 h内甘油的平均消耗速率为0.33 g/(L·h)，生产强度为0.114 g/(L·h)。副产物乙酸随着pH的升高而上升，且在pH由6上升到7时，乙酸的产量大幅增加，发酵终点的乙酸质量浓度分别为3.16和15.42 g/L。在pH恒为8时，发酵终点的乙酸质量浓度为18.68 g/L。所以pH恒定情况下，选择控制pH为6时，目标产物产量产率最高，生成副产物较少。

分析不同pH下的发酵过程，可以发现，菌体在发酵初期，主要以生成2，3-丁二醇为主，在底物消耗完后，乙偶姻大量增加，2，3-丁二醇的浓度则很快减少，且乙偶姻增加的量大于底物消耗量的1/2。由此，笔者认为，在发酵后期，2，3-丁二醇可以自发向乙偶姻转化，这与2，3-丁二醇途径中的由乙偶姻到2，3-丁二醇的反应是可逆的相吻合［15］。这可能是因为在发酵后期，菌体为了维持胞内氧化还原平衡，利用2，3-丁二醇为底物转化为乙偶姻，从而产生一定的还原力［16］。

图1 不同pH控制下的发酵过程曲线Fig.1 Time course of fermentation on different pH controlling

2.2 溶氧对产物生成的影响

为了研究溶氧对产物生成的影响，选取100、200和300 r/min 3种转速条件，调节发酵液初始pH为6，初始甘油质量浓度(以粗甘油计)60 g/L，在发酵罐中进行批次发酵。通过分别流加NaOH或H2SO4控制反应的pH恒为6，发酵结果如图2所示。由图2可以发现:随着转速的提高，底物的消耗速率逐渐变快。在转速为100 r/min时，144 h之后，仅消耗了18.56 g/L甘油，2，3-丁二醇和乙偶姻的产量分别为1.74和1.41 g/L;在转速为200 r/min时，122 h时甘油基本耗尽，2，3-丁二醇和乙偶姻的产量分别为13.54和9.14 g/L;300 r/min时，66.5 h时甘油便耗尽，2，3-丁二醇和乙偶姻的产量分别为5.53和11.96 g/L。与较低的转速相比，高转速的菌体生长速度更快(图3)，且其菌体生长的速率与底物消耗速率呈正相关趋势。但在300 r/min下，底物的转化率却明显降低，为理论转化率的60%，远低于200 r/min下的82%。通过图3的菌体生长曲线，每个取样间隔时间的菌体的平均生长速率(近似等于斜率)在0～23 h内，转速为300 r/min时更快，菌体量也在这段时间内大量积累，达到4.85 g/L，是发酵过程中最大菌体量的79%。在23 h之后，300 r/min转速下的生长速率显著降低，低于200 r/min转速下的生长速率。在0～23 h内，甘油底物消耗了19.06 g/L，生成的产物乙偶姻和2，3-丁二醇仅有4.56 g/L。而在200 r/min转速下，甘油消耗了23.89 g/L，生成的产物为9.91 g/L，而这段时间产物生成的相差(5.35 g/L)约等于最终产量的差(5.19 g/L)。可以推测，在高转速条件下，菌体迅速生长，同时菌体的呼吸作用消耗了大量的底物。在转速为200 r/min下，总的发酵时间约145 h，300 r/min下约75 h。两者相差70 h，一部分是菌体生长对数期时间不同(分别为64与37 h)，另一部分是由2，3-丁二醇氧化为乙偶姻的转化速率不同，从2，3-丁二醇开始转化为乙偶姻到完全转化所用的时间分别为51.5与38 h。转化时间不同可能是因为2，3-丁二醇向乙偶姻的转化需要由氧化型辅酶NAD提供氧化力，较高的溶氧能够降低胞内NADH的含量，从而使反应向有利于乙偶姻生成的方向进行［17］。

2.3 三阶段溶氧调控研究

图2 不同转速下的发酵过程曲线Fig.2 Time courses of fermentation at different agitation speeds

图3 不同转速下对细胞生长的影响Fig.3 Effects of different agitation speeds on cell growth

根据以上结果，笔者设计了一种三阶段溶氧调控实验，按如下方法操作:调节发酵液初始pH为6，初始甘油质量浓度(以粗甘油计)60 g/L，在发酵罐中进行批次发酵。通过分别流加NaOH或H2SO4控制反应中的pH恒为6，在前24 h控制发酵罐搅拌桨转速为300 r/min，24 h时调节发酵罐搅拌桨转速为200 r/min，隔一定时间取样实时测定底物浓度，当底物耗尽时，将转速调回至300 r/min，结果如图4所示。

图4 转速调控的发酵过程曲线Fig.4 Time courses of fermentation by agitation speed operation

由图4可以看出:在改变转速后，产物的消耗速率并未下降，但生成的产物中，2，3-丁二醇所占的比例比恒定300 r/min转速下的更大，这一点也与前述实验中不同溶氧对产物比例的影响相吻合。可见，在微氧发酵过程中，较高的溶氧有利于乙偶姻的生成。最终，经过76 h发酵，乙偶姻的产量为14.62 g/L、2，3-丁二醇为1.24 g/L，总产量为15.86 g/L，生产强度为 0.21 g/(L·h)。转化率达到了理论最大值的68%。所需发酵时间远少于200 r/min恒定转速下的情况。产物生成量与300 r/min恒定转速下的产量接近，在节约能量的同时达到了减少发酵时间、提高产率的目的［18］。

3 结论

通过对多粘类芽胞杆菌AE-308甘油代谢情况的考察，研究了pH、溶氧对菌体生长及产物生成的影响，发现通过控制发酵液保持在恒定的微酸性pH状态可以有效促进产物的积累，而不控制或过高的pH则会导致底物转化缓慢、副产物增加和产物生成降低。转速则与菌体的生长速率存在正相关性，较高的转速会使得菌体生长迅速，但也会使底物转化率降低，且能耗过大。通过对菌体生长阶段、产物积累阶段、2，3-丁二醇向乙偶姻转化阶段采取不同的溶氧调控方式，相比于传统的分批发酵，有效地减少了发酵时间，提高了产物的生成效率，同时在生成的产物中，副产物乙酸极易与乙偶姻分离，2，3-丁二醇的含量很低，仅为1.24 g/L，后期的分离成本和难度也得到了降低，为进一步补料发酵和代谢机制研究奠定了基础。

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