高效液相色谱法测定槐米中槲皮素的含量

赵虎平

（包头医学院第一附属医院药剂科，内蒙古 包头 014010）

高效液相色谱法测定槐米中槲皮素的含量

赵虎平

（包头医学院第一附属医院药剂科，内蒙古 包头 014010）

目的 建立槐米中槲皮素的含量测定方法。方法 利用甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，v/v）检测波长375 nm，其中甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，流速为0.8 mL/min。色谱柱：Diamonsil(TM)C18(416 mm×250 mm，5 μm)。结果 槲皮素在1.964～19.64 mg/mL的浓度范围内峰面积和浓度呈良好的线性关系r=0.9994；测得回收率为98.6%，RSD为1.8%。结论 方法准确可靠、简便，适用于槐米中槲皮素的含量测定。

槐米；槲皮素；高效液相色谱法；含量测定

槐米是豆科植物槐（Sophora japonicaL）的干燥花蕾或花，具有清肝泻火的功能[1]。其主要成分为黄酮类，与槐花的药理作用密切相关。因此，槐花的质量主要由黄酮类的含量决定。黄酮类中的黄酮苷主要包括芦丁及槲皮素等。槲皮素（Quercetin）是黄酮醇的一种代表性化合物，具有很高的药用价值，能够抗氧化、清除氧自由基、降低血压、保护心肌缺血再灌注损伤等[2]。可据此利用槲皮素制作中药制剂，并进行提取。本研究采用加热回流法，对槲皮素进行提取，并建立针对其的HPLC测定方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津，LC-10Tvp）；紫外-可见检测器（SPD-10Avp）；双通道色谱工作站N-2000（浙江大学智能信息工程研究所，浙江大学智能信息工程有限公司）；BS110S电子天平（北京塞多利斯天平有限公司Max为110 g，d=0.1 mg）；KQ-50型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；0.45 µm微孔滤膜；水浴回流装置；容量瓶等。

1.2 试剂

槐米，槲皮素标准品；甲醇（色谱纯），甲醇（分析纯）；水为重蒸馏水；磷酸为分析纯，25%盐酸。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil（TM）C18（416 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，v/v）；检测波长：375 nm；流速：0.8 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品0.001 g，于100 mL量瓶中加适量甲醇溶解、定容配成10 μg/mL的溶液100 mL，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取槐米适量，用研钵研磨，过100目筛得本品粉末。取本品粉末0.12 g，加甲醇-25%盐酸（4∶1）混合溶液水浴回流30 min，放冷，置于50 mL的量瓶中，加甲醇使其稀释至刻度，摇匀即可。

2.4 标准曲线的制作

取槲皮素对照品5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇（色谱纯），超声处理20 min后过滤，加甲醇（色谱纯）定容到刻度，备用。精密量取上述对照品溶液0.20、0.25、1.20、2.00 mL，分别置4个10mL量瓶中，加甲醇（色谱纯）稀释至刻度，摇匀。分别量取20 µL注入色谱仪，记录色谱图。以浓度（C µg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标进行线形回归，得回归方程：Y=107.02X+7616.8。相关系数r=0.9994。表明：在1.964～19.64 mg/mL的浓度范围内，槲皮素的峰面积和浓度呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取对照品溶液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇（色谱纯）稀释至刻度，超声处理后20 µL进样，重复5次，记录峰面积，计算主峰面积的相对标准偏差，其中五次的值分别为134076.031，133516.383，129512.398，137479.516，143425.297，RSD为0.69%。

2.6 重现性试验

取样品粉末0.12 g，进行精密称定后，按上述制备方法和测定条件，重复测定5份。记录峰面积分别为35141.293，32630.783，34890.906，32856.066，36646.836，RSD为0.26%。

2.7 回收率试验

取样品粉末0.12 g，进行精密称定后，按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，重复测定6份。测定结果如表1。测得回收率为98.6%，RSD为1.8%。

3 结果与讨论

3.1 结果

取适量槐米，研磨，过100目筛，约0.12 mg粉末，精密称定后加甲醇-25%盐酸（4∶1）混合溶液25 mL，水浴回流30 min以使其冷却，置50 mL量瓶中精密吸取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇，超声处理20 min使完全溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20 µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测得4批（n=3）样品中槲皮素的含量分别为：12.46%（RSD=0.75%）；9.78%（RSD=1.0%）；9.43%（RSD=0.64%）；11.09%（RSD=0.38%）。

3.2 讨论

3.2.1 检测波长的选择

取适量的槲皮素对照品，以甲醇为溶剂，在紫外可见分光光度计上，于200～600 nm扫描。结果显示，槲皮素在264 nm、375 nm波长处，吸收量最大。在同一条件下经高效液相色谱仪测定，槲皮素的峰面积在375 nm处较264 nm波长处大，因此，选择375 nm作为槲皮素的检测波长。

3.2.2 流动相的选择

调整流动相甲醇-0.4%磷酸溶液的比例（50∶50，55∶45，60∶40，70∶30）20 µL进样，记录色谱图如图1。确定二者比例在60∶40时分离效果最好，而且灵敏度较高。

图1 对照品（甲醇-0.4%磷酸溶液=60∶40，v/v）时的色谱图

3.2.3 溶液水解条件的选择

盐酸水解芦丁为槲皮素，而槲皮素易溶于甲醇，因此，芦丁的水解和槲皮素的提取受到不同比例、体积的甲醇-25%盐酸混合溶液的影响[3]。在本研究中，研究者对水解时混合溶液的比例和体积进行了选择，水浴回流30 min，放冷，置50 mL量瓶中精密吸取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇进行超声处理，使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀、滤过后，精密量取20 µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明在甲醇-25%盐酸总体积为25 mL比例为4∶1时，水解条件最佳结果为甲醇-25%盐酸总体积为25 mL比例为4∶1[4]。取芦丁对照品同法水解，经过薄层色谱法和高效液相色谱法的测定，如图2所示，芦丁已完全水解为槲皮素。

图2 供试品（甲醇-25%盐酸总体积为25 mL比例为4∶1）色谱图

[1] 李力更,李作平,霍长虹.固相萃取-分光光度法联用测定中药槐米中芦丁含量的研究[J].中成药,2003,25(8):673-674.

[2] 李云峰.槲皮素代谢的研究进展[M].生理科学进展,2002,33(1): 53-55.

[3] Hosseini MS,Belador F.Cr (III)/Cr (VI) speciation determination of chromium in water samples by luminescence quenching of quercetin[J].J Hazard Materials,2009,165(1):1062-1067.

[4] Olszewska M.Separation of quercetin,sexangularetin,kaempferol and isorhamnetin for simultaneous HPLC determination of flavonoid aglycones in inflorescences,leaves and fruits of three Sorbus species[J].J Pharm and Biomed Anal,2008,48(3): 629-635.

R446；R9

B

1671-8194（2014）18-0094-02