25株多重耐药鲍曼不动杆菌同源性分析

曹文操，祁艾红

(1.武汉市第一医院检验科，湖北 武汉 430022；

2.武汉市第五医院检验科，湖北 武汉 430050)

25株多重耐药鲍曼不动杆菌同源性分析

曹文操1，祁艾红2

(1.武汉市第一医院检验科，湖北 武汉 430022；

2.武汉市第五医院检验科，湖北 武汉 430050)

目的 分析临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)中仅对黏菌素和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CCOS-AB)菌株的同源性，为控制其流行暴发提供实验数据。方法收集并分析武汉市第一医院2012年1月至2013年12月临床分离的CCOS-AB菌株25株，采用琼脂稀释法测定其耐药性，随机引物多态性DNA扩增(RAPD)和琼脂凝胶电泳分析CCOS-AB菌株的同源性。结果电泳结果显示，25株CCOS-AB菌株分为12个克隆株，A型克隆包括2株，B型克隆包括5株，C型克隆包括6株，D型克隆包括2株，E型克隆包括3株，F、G、H、I、J、K、L型克隆各1株。结论该院2012-2013年期间CCOS-AB存在5型克隆株的院内流行，临床应加强院内感染控制。

不动杆菌属；多重耐药；随机引物多态性DNA；同源性分析

近年来随着大量抗菌药物的使用，不动杆菌耐药性不断增加，多重耐药甚至泛耐药菌株分离率明显增高[1]，一旦感染将给临床治疗带来极大困难。Falagas等[2]定义的不动杆菌CCOS株(Colistin-carbapenem-only-sensitive，仅对黏菌素、碳青霉烯类敏感)耐药情况十分严峻。本院检验科监控数据显示重症监护病房(ICU)分离的CCOS-AB菌株数量明显增多，可能存在院内流行。本研究将对临床分离的CCOS-AB菌株进行同源性分析，为医院感染控制提供依据。现结合临床资料分析，报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 25株CCOS-AB菌株均分离自本院2012年1月至2013年12月的临床标本(24株为痰标本，1株为胸腔积液)，感染者年龄(50.9±14.2)岁，男性17例，女性8例。其中5～13号、17～24号共17株来自本院ICU病区，其余8株来自非ICU病区(烧伤科、脑外科、胸外科、消化科)。药敏结果均为对多黏菌素敏感，对亚胺培南敏感，同时对青霉素类、头孢菌素、单环类抗生素、氟喹诺酮、氨基糖苷类抗菌药物均耐药。菌株分离鉴定采用法国梅里埃公司的全自动微生物分析系统VITEK-2鉴定，采用琼脂稀释法测定抗菌药物的敏感性，操作过程及判断标准参照2012年版CLSI指南中的有关规定[3]。以ATCC25922大肠埃希菌、ATCC27853铜绿假单胞菌为室内质控菌株。

1.2 方法

1.2.1 RAPD扩增分析 菌株DNA提取采用上海生工基因组抽取试剂盒。RAPD分型引物M13 (5'-TTATGTAAAACGACGGCCAGT-3')、H5(5'-AGT CGTCCCC-3')，PCR反应体系：MgCl2(2 mM)，dNTP (0.2 mM)，Primer(1 pmol/μl)，DNA模板1 μl，Taq聚合酶2.5 U。反应条件：94℃变性4 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min为1个循环，共40个循环；最后72℃延伸5 min。PCR引物、DNA分子量标准、Taq酶等试剂均由上海生工生物工程有限公司提供，检测仪器为美国伯乐PTC-220PCR仪。

1.2.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析 1.5%琼脂糖凝胶电泳40 min，电压110 V，GelRed染色，照相。GelRed核酸染料由美国Biotium公司提供。检测仪器为电泳仪、GEL DOC4R型凝胶成像系统，均来自美国伯乐公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件对电泳条带模式进行聚类分析，绘制菌株间关系的树状图，根据树状图判断菌株间的相互关系。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳分析结果 25株菌株采用M13、H5两种随机引物进行RAPD分型，电泳条带图谱见图1、图2。

图1 H5分型引物RAPD扩增产物电泳结果

图2 M13分型引物RAPD扩增产物电泳结果

2.2 25株菌株指纹条带树状图 按文献[4]报道的RAPD分型判定原则，参照聚类分析树状图(见图3)得出如下分类结果：A型克隆包括2株(2、3)，B型克隆包括5株(4、6、7、8、9)，C型克隆包括6株(11、13、14、15、16、17)，D型克隆包括2株(19、21)，E型克隆包括3株(22，23，24)，F、G、H、I、J、K、L型克隆各1株。

图3 25株菌株指纹条带树状图

2.3 25 株菌株临床资料 2012年1月检出A型克隆株2株，出现在烧伤科和脑外科病区；2012年1月至2012年9月检出B型克隆株5株，出现在烧伤科、ICU两个病区；2012年10月至2013年1月检出C型克隆株6株，出现在ICU、脑外科、胸外科三个病区；2013年3月ICU检出D型克隆株2株；2013年4月至5月ICU检出E型克隆株3株。

3 讨论

近年来，鲍曼不动杆菌已成为医院感染的重要病原菌之一，且有逐年上升的趋势，随着广谱抗生素药物的滥用，耐药情况呈现多重性。有研究证实如果CCOS菌株在碳青酶烯类抗菌药物的选择性压力下极可能转变为仅对多粘菌素敏感的COS株(Colistin-only-sensitive)，甚至转变为对7类抗假单胞类药物均耐药的PDR株(Pan drug-resistant)[5]。

本研究对我院近年来分离的25株不动杆菌CCOS-AB菌株进行同源性分析，得出12类不同克隆株，其中5类克隆株在多个病区或患者中检出。以C型克隆株为例，从2012年10月第一次分离到2013年1月仍有此临床分离株出现，存在ICU病房内交叉感染，并且出现了ICU与其他病区间的传播现象，提示院内可能存在C型克隆株的流行感染，该克隆株可能通过某种途径造成ICU、脑外科、胸外科等多个科室的交叉感染，应引起医务工作者的重视。赵霞等[6]对2009年8月7～14日北京宣武医院住院患者检出的多药耐药鲍曼不动杆菌进行同源性分析，发现1周内检出的10株MDR-AB中9株为同源菌株，确定存在医院内流行株。经过强化控制措施后，9个月检出的12株MDR-AB中的同源菌株下降为2株，有效遏制了流行株的蔓延。强化预防与控制包括:加强医务人员手卫生清洁；增加环境清洁、消毒频次；严格实施隔离措施，必要时实施接触隔离；严格遵守无菌技术操作规程；合理使用抗菌药物等措施。

因此对临床分离菌株进行同源性分析，对于那些存在时间跨度长，出现多个临床科室交叉感染的菌株确定其感染途径和传播途径，强化预防和控制措施，可以防止其散播流行，对于有效控制多重耐药不动杆菌感染具有重大意义。

[1]任碧云,鲁美茹,来艳君.鲍氏不动杆菌医院感染分布及耐药性分析[J].海南医学,2012,23(23):97-99.

[2]Falagas ME,Bliziotis IA,Kasiakou SK,et al.Outcome of infections due to pan drug-resistant(PDR)Gram-negative bacteria[J]. BMC Infectious Diseases,2005,5(1):24-29.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically;approved standard-ninth edition[S].Clinical and Laboratory Standards Institute,2012,M07-A9.

[4]Hsueh PR,Teng LJ,Yang PC,et al.Persistence of a multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa clone in an intensive care burn unit [J].Clinical Microbiology,1998,36(5):1347-1351.

[5]Jones RN.Microbial etiologies of hospital-acquired bacterial pneumonia and ventilator-associated bacterial pneumonia[J].Clinical Infectious Diseases,2010,51(S1):81-87.

[6]赵 霞,王力红,张京利,等.多药耐药鲍氏不动杆菌的同源性鉴定与控制[J].中华医院感染性杂志,2012,22(12):2492-2494.

Homology analysis of 25 multi-drug resistant Acinetobacter baumannii

CAO Wen-cao1，QI Ai-hong2
1.Department of Clinical Laboratory,the First Hospital of Wuhan,Wuhan 430022,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the Fifth Hospital of Wuhan,Wuhan 430050,Hubei,CHINA

ObjectiveTo analyze the homology of clinical isolated CCOS-AB(colistin-carbapenem-only-sensitive Acinetobacter baumannii)strains,and provide experimental data for controlling the epidemic outbreak.MethodsWe collected and analyzed CCOS-AB strains isolated from the First Hospital of Wuhan during January 2012 to December 2013.Resistance was determined by agar dilution method,random primers amplified polymorphic DNA(RAPD)and agarose gel electrophoresis was used to analyze the homology of CCOS-AB.Results25 CCOS-AB strains were divided into 12 clones.There were two strains in A-type,5 strains in B-type,6 strains in C-type,2 strains in D-type,3 strains in E-type,and 1 strain in each type of F,G,H,I,J,K and L.ConclusionFive type clones of CCOS-AB are widespread in 2012 and 2013.It should be strengthened in the hospital infection control.

Acinetobacter;Multi-drug resistance;Random primers polymorphic DNA;Homology analysis

R378.2

A

1003—6350(2014)15—2240—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.15.0870

2014-02-03)

祁艾红。E-mail：qiaihong@163.com