大鼠运动性肾脏缺血再灌注损伤及肉苁蓉配伍维生素C的保护作用

周俊飞　曹建民　周海涛

摘要：目的：研究肉苁蓉配伍维生素C对大鼠运动性肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法：将6周龄雄性Wistar大鼠96只为对象随机分为6组：对照组（C组，12只）、一般训练组（M组，12只）、过度训练组（OM组，24只）、肉苁蓉+过度训练组（COM组，16只）、维生素C+过度训练组（VCOM组，16只）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（CVCOM组，16只），进行56 d的力竭游泳训练。COM组、CVCOM组采用专业灌胃器灌胃（ig），每天一次，剂量为6.01 g·kg-1，ig体积为5 mL·kg-1；VCOM组、CVCOM组采用腹腔注射（ip），剂量为100 mg·kg-1，每天一次，注射体积为0.5 mL，其他各组ig等量生理盐水。末次训练后24 h，进行血清尿素氮、血清肌酐等生化指标检测。结果：1）8周的过度训练导致大鼠运动性肾缺血“再灌注”，肾组织超微结构被严重破坏、组织病理学发生明显改变，肾功能受到严重损坏。2）血尿素氮和血清肌酐上升。OM组（P<0.01）、COM组（P<0.01）、VCOM组（P<0.01）、CVCOM组（P<0.05）高于C组；COM组（P<0.05）、VCOM组（P<0.05）、CVCOM组（P<0.01）低于OM组；COM组（P<0.05），CVCOM组（P<0.01）低于VCOM组。3、SOD活性降低。OM组（P<0.01）、COM组（P<0.01）、VCOM组（P<0.01）、CVCOM组（P<0.05）低于C组；COM组（P<0.05）、VCOM组（P<0.05）、CVCOM组（P<0.01）高于OM组；COM组（P<0.05），CVCOM组（P<0.01）高于VCOM组。4、MDA含量升高。OM组（P<0.01）、COM组（P<0.01）、VCOM组（P<0.01）、CVCOM组（P<0.05）高于C组，COM组（P<0.05）、VCOM组（P<0.05）、CVCOM组（P<0.01）低于OM组；COM组（P<0.05），CVCOM组（P<0.01）低于VCOM组。结论：1）过度训练造成了大鼠肾脏缺血再灌注损伤。2）肉苁蓉和维生素C均可以增强SOD活性，清除氧自由基，减轻脂质过氧化作用，对运动性缺血再灌注肾脏具有保护作用。3.肉苁蓉作用优于维生素C，二者配伍使用效果更好。

关键词：肉苁蓉；维生素C；运动性缺血再灌注

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2014）02-0070-05

1. Department of P.E.， Guangdong University of Foreign Studies， Guangzhou 510420， China； 2.Beijing Sport University， Beijing 100084， China；3.Biochemical Engineering College of Beijing Union Univers， Beijing 100023，ChinaAbstract：Objective：To study the Herba Cistanches combined with vitamin Cs protective effect and mechanism of movement in rats renal ischemia-reperfusion injury.Methods：Randomly divide 96 7-week-old male Wistar rats into 6 groups： control group （group C， 12）， general training group （group M， 12）， overtraining group （group OM， 24）， cistanche + overtraining group （group COM， 16）， vitamin C+ overtraining group （group VCOM， 16），and cistanche + vitamin C+overtraining group （group CVCOM， 16），take a 56-day of exhaustive swimming training. The COM group， CVCOM group with professional gavage for gastric lavage （ig）， once a day， the dose of 6.01 g.kg-1， Ig volume 5mL.kg-1； group VCOM， group CVCOM ip take intraperitoneal injection，100 mg.kg-1， once a day， the injection volume is 0.5 mL；other groups ig normal saline. Detect biochemical parameters of serum urea nitrogen and serum creatinine 24 hours later after the last training.Results：1）In the 8 week of overtraining，rats resulted in movement of “renal ischemia reperfusion”， the ultrastructure of kidney was severely damaged， the histopathological changes obviously， renal function was seriously damaged. 2）Serum creatinine and blood urea nitrogen rise. OM group （P<0.01）， COM group （P<0.01）， VCOM group （P<0.01）， CVCOM group （P<0.05） higher than in group C； COM group（P<0.05）， VCOM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） lower than the OM group； COM group（P<0.05）， CVCOM groups（P<0.01） lower than the VCOM group.3）SOD activity decreased. OM group （P<0.01）， COM group （P<0.01）， of VCOM group（P<0.01）， CVCOM group（P<0.05） lower than in group C； M group（P<0.05）， COM group（P<0.05）， VCOM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） higher than the OM group； COM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） higher than the VCOM group.4）The content of MDA increased，OM group （P<0.01）， COM group（P<0.01）， VCOM group（P<0.01）， CVCOM group（P<0.05） higher than in group C；COM group（P<0.05）， VCOM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） lower than the OM group；COM group（P<0.05）， CVCOM groups （P<0.01） lower than the VCOM group.Conclusion：1）Overtraining can induce the renal ischemia-reperfusion in rats.2）Cistanche deserticola Y.C.Ma and vitamin C can enhance the activity of SOD， scavenging oxygen free radicals， reduce lipid peroxidation，they have a protective effect on exercise-induced ischemia-reperfusion kidney. 3）Cistanche is better than vitamin C，but they worked even better when taken both.

Key words：herba cistanches；vitamin C； exercise-induced ischemia-reperfusion

随着现代中医药理论的发展、现代药理学理论及现代生物技术的更新，更多的单剂或配伍组方应用于体育实践。中药以其多靶点、多途径作用且几乎不含违禁成分的特点日益显示出其独特的优势，在提高运动员身体机能及缓解疲劳方面取得了一定的成就。机体在稳定状态下，肾血流量可以通过自身调节机制来维持相对恒定。在剧烈运动时，肾血流在神经和体液因素的影响下发生改变。由于各器官血流量重新分配，使活动器官特别是肌肉的血流量增多，肾血流量急剧下降，并伴随运动过程的持续和强度递增表现的更加明显[1]。肾脏的这种不完全缺血状态形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动性肾缺血后的“再灌注”[2]。缺血再灌注损伤过程中，自由基的产生异常增多起着重要作用。研究表明，肉苁蓉具有提高过氧化物岐化酶活性、降低脂质过氧化物的药理作用，可以清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤[3]；维生素C作为体内重要的抗氧化剂，也可以有效地清除自由基[4]。本文研究肉苁蓉配伍维生素C对大鼠缺血再灌注肾脏的影响，并探讨二者在缺血再灌注损伤中的作用及其机制，旨在为其临床应用提供理论依据。

1材料

1.1动物

清洁级雄性Wistar大鼠100只，42 d龄，平均体重（201.8±14.1）g，北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号SCXK（京）2006-0008。在整个试验过程中，实验室内温度保持在（22±2）℃，相对湿度55%～75%，光照时间随自然变化。所有试验大鼠均以基础饲料（北京大学医学部实验动物科学部提供）和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间为63 d，正式训练时间为56 d。

1.2实验用药肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma），产自内蒙，北京同仁堂药店购得，批号：120224536并经天津中瑞药业有限公司高占友高级工程师鉴定。将干燥带鳞叶的肉苁蓉粉碎成粗粉，用10， 6， 6倍量60%乙醇水浴提取3次，每次2 h，合并提取液冷藏24 h，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩成浸膏（相当于2.0g生药/g浸膏），备用[3]。维生素C注射液（批号20120406），北京双鹤药业提供。

1.3试剂血清肌酐（serum creatinine， Scr）采用Jaffe苦味酸法测定，血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）采用二乙酰-肟法测定，丙二醛（malondialdehyde， MDA）采用比色法测定；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），采用黄嘌呤氧化酶法测定，均采用南京建成生物工程研究所提供试剂盒，试剂盒编号20120511，并严格按照使用说明操作。

1.4仪器BS224S型电子分析天平（德国赛多利斯）、光学显微镜（日本OLYMPUS公司）、ALCYON300全自动生化分析仪（美国雅培）、756MC型紫外-可见分光光度计（上海精密仪器厂）及GL-20G高速冷冻离心机（上海安亭）。

2方法

2.1动物分组

实验大鼠适应性饲养4 d后，以20 min/d的运动量对其进行为期3 d的筛选，淘汰个别不适应游泳训练者，将剩余大鼠以数字随机分组法分6组：对照组（C组）12只，一般训练组（M组）12只，过度训练组（OM组）24只，肉苁蓉+过度训练组（COM组）16只，维生素C+过度训练组（VCOM组）16只， 肉苁蓉+维生素C+过度训练组（CVCOM组）16只进行56 d的游泳训练。训练期间，COM组、CVCOM组采用专业灌胃器灌胃（ig），每天一次，剂量为6.01 g/kg，ig体积为5 mL/kg；VCOM组、CVCOM组采用腹腔注射（ip），剂量为100 mg/kg ，每天一次，注射体积为0.5 mL（通过预实验获得最佳剂量），其他各组ig等量生理盐水。

2.2实验方法

2.2.1训练及测试方案

C组常规饲养，不加任何干预，平时不运动。M组进行中等强度游泳训练，正式游泳训练8周。每周训练6 d，每天训练1次，第一次下水游20 min，此后逐渐增加，至第1周末时每天游60 min，第2周末时加至每天游90 min，第3周末时加至每天游120 min，此后5周均保持此运动量。其他各组前3周训练安排同M组，第4周起开始安排高强度训练。大鼠进行负重游泳，每次训练至力竭。力竭标准以大鼠下沉后10 s不露出水面为度。第1～3周负0.5%体重，第4周负1%体重，第5周负2%体重，每天训练1次。第6周每天上、下午各训练1次，第7～8周，每天上、下午、夜间各训练1次，均负5%体重。至第8周末，C、M组大鼠，均正常生长，无意外死亡发生。其他各组大鼠因尾部负重，疲劳衰竭不能恢复及训练意外死亡等原因，死亡率较高。OM组、COM组、VCOM组、CVCOM组分别剩余14、13、11、13只。各组分别取10只用于实验取材，其他随机剔除。

2.2.2指标测定

各组大鼠于末次游泳训练24 h后，乙醚适度麻醉，从颈总动脉处取血加入柠檬酸钠溶液抗凝，37℃水浴中30 min后，4℃ 3 000 rpm离心10 min，分离制备血清，置-20℃冰箱中保存待查。迅速取双肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，肉眼观察肾脏大小、色泽、质地。分离左肾，取肾上极组织0.5 g，用1.5 mL生理盐水在1℃下以12 000 rpm研磨制成10%肾组织匀浆；10%甲醛固定肾组织标本，石蜡包埋，制成4 um厚切片，HE染色，观察组织病理学变化。

2.2.3肾脏病理变化评价

参照Pallers标准[5]，在400倍光镜下随机选5个视野，每个视野选10个肾小管评分。1）肾小管明显扩张，细胞扁平为1分；2）刷状缘损伤为1分，脱落为2分；3）细胞膜大泡1分，细胞浆空泡1分；4）间质水肿1分；5）肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片为1分，形成管型或碎片为2分。肾小管评分由两名技术员双盲计算，取其平均值。

2.3数据统计

所有数据均用SPSS 12.0统计软件包进行处理，数据以平均数±标准差（±s）表示，资料进行正态性检验；多组计量资料采用one-way ANOVA，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T3法。P<0.05有统计学意义。

3结果

3.1运动及肉苁蓉、维生素C对大鼠肾组织的病理改变

Scr和BUN测定后取各组肾组织制作石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察组织形态学变化。光镜下静止对照组、一般训练组大鼠肾组织结构正常，无淤血、变性和水肿，肾小管管腔内无管型。过度训练组大鼠肾小球有淤血现象，小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张，管腔中有少量的脱落绒毛和上皮细胞，以及各种管型。其他各组组织病理学改变较过度训练组轻，有轻微的小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张现象，无蛋白管型和细胞管型。各组大鼠肾小管Paller [5]评分，静止对照组、一般训练组组间无显著差异（P>0.05），静止对照组明显低于其他组（P<0.01），治疗组显著低于过度训练组大鼠（P<0.05），且均未见肾小球明显病理改变。

由表2可知，血尿素氮和血清肌酐各组较对照组明显上升，与OM组相比COM组、VCOM组、CVCOM组明显下降（分别为P<0.05、P<0.05、P<0.01）；与VCOM组相比，COM组、CVCOM组明显下降（分别为P<0.05，P<0.01）。

3.3运动及肉苁蓉、维生素C对大鼠肾组织匀浆中SOD活性和MDA含量的影响

由表3可知，SOD活性各组较对照组明显降低，与OM组相比COM组、VCOM组、CVCOM组明显上升（分别为P<0.05、P<0.05、P<0.01）；与VCOM组相比，COM组、CVCOM组明显上升 （分别为P<0.05，P<0.01）。MDA含量各组较对照组明显升高，与OM组相比COM组、VCOM组、CVCOM组明显下降，（分别为P<0.05、P<0.05、P<0.01）；与VCOM组相比，COM组、CVCOM组明显降低（分别为P<0.05、P<0.01）。

4讨论

肾缺血再灌注（Ischemic reperfusion，I/R）损伤是一个复杂的病理生理变化过程，其具体机制尚未完全阐明。但氧自由基（Oxygen free radicals，OFR）在I/R发生、发展过程中起着至关重要的作用[6]。正常情况下，体内可产生少量自由基，但由于体内具有灭活自由基酶系统，自由基被迅速清除，不产生损伤作用。运动时由于I/R使自由基产生增加，可引发膜脂质过氧化反应，导致膜的液态性、流动性及通透性改变，进而造成膜功能障碍，尤其是线粒体膜的破坏将影响细胞的代谢和机能，并干扰整个器官的生理功能。机体内存在清除自由基、减轻其危害的主要物质是抗氧化酶。SOD是需氧生物体内数千种酶中以氧自由基为底物的唯一酶。其通过催化超氧阴离子形成过氧化氢而清除超氧阴离子，保护机体免受损伤，同时在一定范围内，自由基代谢增强时，SOD会代偿性增加。因此SOD活性的高低是机体抗氧化能力强弱的标志。MDA是细胞脂质过氧化的一种主产物。组织线粒体MDA含量是目前公认的衡量机体自由基代谢的敏感指标[7]。肌酐和尿素氮分别是肌肉和蛋白质的分解代谢产物，主要经血循环从肾脏排除体外，其血中的浓度取决于肾小球滤过能力，当肾脏实质受到损伤，肾小球滤过率降到临界点后，二者的浓度就会明显上升[8]。

实验结果显示，8周的过度训练导致大鼠肾组织组织病理学发生明显改变；血尿素氮、血清肌酐增高（过度训练组（P<0.01）、肉苁蓉+过度训练组（P<0.01）、维生素C+过度训练组（P<0.01）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.05）高于静止对照组）；SOD活性降低（过度训练组（P<0.01）、肉苁蓉+过度训练组（P<0.01）、维生素C+过度训练组（P<0.01）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.05）低于静止对照组）；MDA含量升高（一般训练组（P<0.05）、过度训练组（P<0.01）、肉苁蓉+过度训练组（P<0.01）、维生素C+过度训练组（P<0.01）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.05）高于静止对照组）。这说明过度训练已造成大鼠肾脏运动性缺血“再灌注”损伤，肾功能受到严重损坏。但肾组织组织病理学改变肉苁蓉+过度训练组、维生素C+过度训练组、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.05）较过度训练组明显减轻。血尿素氮和血清肌酐含量肉苁蓉+过度训练组（P<0.05）、维生素C+过度训练组（P<0.05）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.01）低于过度训练组；SOD活性，肉苁蓉+过度训练组（P<0.05）、维生素C+过度训练组（P<0.05）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.01）高于过度训练组；MDA含量，肉苁蓉+过度训练组（P<0.05）、维生素C+过度训练组（P<0.05）、肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.01）低于过度训练组。表明，肉苁蓉及维生素C可以有效清除自由基，减轻肾脏的缺血缺氧，抑制脂质过氧化作用，提高SOD活性。有效减轻肾脏缺血再灌注损伤，起到保护作用。其机制可能为：1）肉苁蓉可以提高抗氧化酶活性，加快自由基的消除，同时所含的多种多酚类、苷类、黄酮类物质，对清除机体自由基、减轻自由基对线粒体膜和肌浆网膜造成损伤，以及减轻对酶蛋白的氧化损伤起到积极作用[3]。2）维生素C是重要的抗氧化维生素，作为强抗氧化剂可有效清除氧自由基、抑制凋亡级联的启动而减轻细胞、器官的缺血再灌注损伤[9]。此外，3个治疗组间比较，血尿素氮、血清肌酐、MDA含量，肉苁蓉+过度训练组（P<0.05），肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.01）低于维生素C+过度训练组；SOD活性，肉苁蓉+过度训练组（P<0.05），肉苁蓉+维生素C+过度训练组（P<0.01）高于维生素C+过度训练组。提示肉苁蓉对运动性肾脏缺血再灌注损伤的疗效可能优于维生素C；而二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注损伤肾脏的保护。

综上所述，大负荷游泳训练造成了大鼠肾脏缺血再灌注的损伤，肉苁蓉和维生素C均对肾脏缺血再灌注损伤具有明显保护作用，可能是通过增强超氧化物歧化酶活性，清除自由基，减轻脂质过氧化作用，进而改善肾脏功能。就疗效而言，二者配伍使用优于二者单独应用，而肉苁蓉又优于维生素C，但也可能和二者在应用中的剂量大小有关，其剂量和疗效之间的关系，还有待进一步研究。

参考文献：

[1] Barclar WF. Review of Medical Physiology[M].California： lange Medical Publication，1995：577-580.

[2] Heifets M， Davis T A， Tegtmeyer E，et al.Exercise training ameliorates progressive renal disease in rats with subtotal nephrectomy[J].Kidney Int，1987，32（6）：815-820.

[3] ZHOU H T（周海涛），CAO J M（曹建民），LIN Q（林强）. Effect of Cistanches Herba on the Swimming Ability and Oxidation Resistance of Mitochondrial in Rats[J].Chin J Exp Tradit Med Form（中国实验方剂学杂志），2012，18（6）：229-233.

[4] Palazzetti S， Rousseau A S， Richard M J，et al.Antioxidant supplementation preserves antioxidant response in physical training and low antioxidant intake[J].Br J Nutr，2004，91（1）：91-100.

[5]Paller M S， Hoidal J R， Ferris T F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J].J Clin Invest，1984，74（4）：1156-1164.

[6]Wang L（王丽）， Mei C L（梅长林）. Hypoxia-inducible factor-1α and oxygen free radicals in renal ischemia-reperfusion injury in rats[J].Chin J Nephrol（中华肾脏病杂志），2006， 22（7）：371-373.

[7]Chen PJ， Hirata F. The effects of long-term training at various loads on immunity and neuroendocrine responses in rats[J].J. NIFS-KJ，1998，20（1）：19-26.

[8]Hong P（洪平）， Chen G（陈耿）， Li Q Z（李清正），et al.Influence of Rapid Weight Loss by Different Temperature on Certain Biochemical Indexes[J].Chin sport sci（体育科学），2010，30（4）：44-48.

[9]Korkmaz A， Kolankaya D. The protective effects of ascorbic acid against renal ischemia-reperfusion injury in male rats[J].Ren Fail，2009，31（1）：36-43.