陆生动物诊断实验和疫苗手册(2013版):蜜蜂盾螨病

2014-05-25 00:35徐国群郑火青译
中国蜂业 2014年11期
关键词:螨虫显微镜蜂群

徐国群郑火青译

(1浙江衢州出入境检验检疫局,衢州324002;2浙江大学动物科学学院,杭州310016)

陆生动物诊断实验和疫苗手册(2013版):蜜蜂盾螨病

徐国群1郑火青2译

(1浙江衢州出入境检验检疫局,衢州324002;2浙江大学动物科学学院,杭州310016)

蜜蜂盾螨病(Acarapisosis or acariosis or acarine disease)是西方蜜蜂和其他蜜蜂种成年蜂的一种疾病,由跗线螨(Tarsonemid mite),也被称为气管螨(tracheal mite),武氏蜂盾螨(Rennie亚种)(Acarapis woodi)引起。螨虫体长约150 μm,是蜜蜂呼吸系统的一种体内寄生虫,主要在蜜蜂的前胸气管内生活、繁殖。有时也寄生在头、胸和腹部气囊。螨虫以寄主的血淋巴为食。

对被感染蜜蜂的致病作用取决于气管内的寄生螨虫数量,引起机械损伤和生理紊乱,并导致气道阻塞,气管壁病变和血淋巴衰竭。随着寄生螨虫数量增长,由于黑色素的缘故,气管壁由正常的白色半透明变成不透明并带有黑色疤痕。

死亡率中等到高。感染的早期表现通常被忽视,只有当感染较严重时临床症状逐渐明显。发病通常在早春,通过直接接触感染。一般来说,只有新出房10天内的蜜蜂容易感染。在成年蜂气管内繁殖,雌螨一次产8~20粒卵。雌螨数量是雄螨的2~4倍。雄螨发育期为11~12天,雌螨14~15天。

病原鉴定:寄生螨虫须通过实验室方法和显微镜检诊断。观察蜜蜂气管内的螨虫或者将它们移至显微镜下观察。有几种用于诊断螨虫的技术,如解剖法、研磨法和染色法。

解剖疑似感染蜜蜂的胸部,暴露气管。在18~20倍解剖显微镜下检查每根气管,通过透明气管壁可见小的椭圆形螨虫体。或将疑似感染蜜蜂的大量样品进行研磨或在水中混匀,随后粗过滤和离心悬浮液。沉淀物用未稀释的乳酸处理10分钟,然后再用显微镜检查。

利用组织学技术染色,在蜜蜂气管内可观察到寄生螨虫。分离气管,用浓度8%的氢氧化钾溶液清洗,再用浓度1%的亚甲基蓝溶液染色。这是处理大量样品的最佳方法。

血清学试验:血清学试验不可用。

疫苗和诊断生物制品要求:没有可用的生物制品。薄荷醇晶体或者用植物油(不是动物脂肪)和颗粒白糖制成饼能将螨虫数量控制在可控范围内。

图1 武氏蜂盾螨(Rennie亚种)。上:成年雄性,中:成年雌性,下:卵

一、介绍

蜜蜂盾螨病(Acarapisosis)是西方蜜蜂和其他蜜蜂种(Apis species)成年蜂的一种疾病,由细跗线螨科的武氏蜂盾螨(Rennie亚种)引起。螨虫体长约150 μm,是蜜蜂呼吸系统的一种体内寄生虫(图1)。这些气管螨侵入蜜蜂的大前胸气管,并生长、繁殖,以寄主的血淋巴为食(图2)。有时也寄生在头、胸和腹部气囊。

对蜜蜂个体的致病作用取决于气管内寄生螨虫的数量,同时造成机械损伤和生理紊乱,并导致气道阻塞,气管壁病变和血淋巴衰竭。随着寄生螨虫数量的增长,由于黑色素的缘故,气管壁由正常的白色半透明变成不透明并带有黑色疤痕。

死亡率中等到高。感染早期症状只是蜂群规模缓慢衰落,通常被忽视。只有当感染较严重时才逐渐明显。发病通常在早春,经过冬季的结团之后,螨虫进行繁殖,加上没有干扰进入越冬蜂群。这主要适用于北半球,蜜蜂繁殖有季节性变化的地区。

蜜蜂之间直接接触造成传染扩散。一般只有10天内新蜂易感染。尝试用人造及合成饲料饲养武氏蜂盾螨未能成功,而在蜜蜂的不成熟阶段培养它们也只是部分成功。死蜂体内中螨存活约1周。在成年蜂气管内繁殖,雌螨一次产8~20粒卵。雌螨数量比雄螨多2~4倍。雄螨发育期为11~12天,雌螨14~15天。

诊断蜜蜂盾螨病缺乏典型的临床表现,其感染症状不特定,蜜蜂的表现与感染其他疾病或病症的蜜蜂大致相同。它们在蜂箱的前面爬行,在草的叶片上攀爬,不能飞行。可能同时患痢疾。

二、诊断技术

1.病原鉴定

在实验室里仅需用显微镜检查或者酶联免疫吸附方法(ELISA)就可检出蜜蜂盾螨病。目前,还没有检出感染水平非常低的可靠方法。蜜蜂样品的数量决定了该方法的检测阈值。采用顺序采样,抽取50只蜜蜂样品可检测约1~2%的感染率,已经证明,数据是有效的。采取蜜蜂样本的最佳时间是在早春或晚秋(北半球),此时蜂盾螨的群体高。老龄蜂有更多的螨虫,更容易肉眼观察到。蜂王、雄蜂或者工蜂都可以作为样品,但蜂盾螨偏爱雄蜂。

a)解剖法

从可疑蜂群随机抽取50只蜜蜂样品,主要来自蜂箱前3米范围内爬行和不能飞行的蜜蜂。这是从蜂群中随机取样最好的方法。蜜蜂可能是活的、濒死或死亡的。活蜂先用酒精或冷冻(-20℃)致死;死亡蜜蜂可在4℃保存4周,或-20℃保存几个月,否则不能超过2~3天。可在防腐剂中长期保留,如Oudemann溶液:冰醋酸(80 ml);甘油(50 ml);70%酒精(870 ml)。

(1)直接制备法,试验步骤:

i)从蜜蜂的胸部去掉腹部(见图3)。

ii)由头部顶端拿起胸部,在双目放大镜下放大20~30倍检查。

iii)用一对镊子,去除第一胸节的侧胸骨片和第一对足。环形开口可见胸部气管的主干和头部的分支气管。

iv)用一对细镊子,去除第一胸节胸背甲和第二胸节部分胸背甲。清除覆盖的肌肉,暴露两根胸气管。若1根或2根气管有黑变,或在气管内易见椭圆形的半透明体(卵等)存在(轻微感染时),可诊断为阳性。。

图3 准备工作,用于呈现蜜蜂第一胸节气管内的武氏蜂盾螨

v)如需进一步显微镜检查(如确认轻微感染),取下气管,并把它们放到一个载玻片上,加1滴水。在100倍放大倍率的显微镜下,可以辨别成年螨虫以及其生长的各个阶段,。

(2)浸离法,试验步骤:

i)背朝下仰卧固定,或用拇指和食指捏住。

ii)用小镊子去掉头和前足,去除颈四周的颈片,暴露气管(图4)。检查离气门最近的气管(因螨虫通过气门进入气管)看是否有轻微感染。严重感染容易在清晰的深褐色气管看见阴影或深色疤痕。老旧的严重感染将导致气管棕色至黑色。

iii)在中间两肢前和前翅基部位置分别用锋利刀片切断胸部,所得的薄圆片经进一步处理,清除肌肉组织。

iv)浸软,置8%氢氧化钾溶液微加热约20分钟,或不加热静置过夜。

v)用18~20倍放大倍率的解剖显微镜检查有肌肉组织覆盖的第一对气管,或将气管移到另一载玻片上,加甘油或水,以更高的放大倍率观察。

vi)通过透明的气管壁可容易看到小的卵圆形螨虫体。

图4 左:前视图,去除头部的蜜蜂胸腔,颈片完好。右:去除颈片,气门开口处暴露气管

这是实验室诊断蜜蜂盾螨病最简单、最可靠的技术,能检测早期感染,确定感染率。即使是轻微的感染,也可以利用这项技术,使用解剖显微镜进行检测。只有在非常特殊的情况下,才有必要在诊断时采用更高的放大倍率。然而,这项技术要求较高,特别是需要诊断大量蜜蜂盾螨病。如果只需要区别严重感染、轻微感染或未感染的蜂群,只需要解剖至第二步,观察气管的颜色即可。

b)研磨法

随机从疑似感染蜂群中抽取200只蜜蜂样品。从胸部去除每只蜜蜂的翅和足,将剩余身体部分浸入盛有四分之一水的100 ml容器中。加入更多水,将悬浮液以10000 rpm在匀浆器上匀浆3次,每次几秒钟。将所得悬浮液用筛(目数0.8mm)过滤,并且用水冲洗筛,得到最终体积近50 ml的液体。将滤液1500转离心5分钟,弃上清液。沉淀物可能含有螨虫,加几滴未经稀释过的乳酸溶液。静置10分钟,使肌肉纤维溶解。然后装在一个盖玻片镜检。

这项技术比解剖法更快,但不够精确。体外寄生螨外蜂盾螨、游离蜂盾螨和背蜂盾螨,在外观上与武氏蜂盾螨相似,在健康蜜蜂的胸部常常可以发现,很容易被误认为是武氏蜂盾螨(表1)。然而他们并不对蜜蜂或养蜂业造成严重威胁。因此,这种方法只能用于粗略估计一个地区感染程度,不适合用于第一次暴发时确诊。

表1 Acarapis种的鉴别诊断

c)染色法

对螨虫和气管进行特别染色,显微镜下易见。

测试步骤:

i)去掉头和前足。

ii)在前足后面的膜状区域横切一刀。

iii)在前翅的基部,中间一对腿前面,再横切一刀。

iv)切片(1~1.5mm厚)清理干净后,置8%氢氧化钾溶液。

v)轻轻搅拌,加热至接近沸点约10分钟,直至软的内部组织溶解、清除,保持几丁质组织完好。

vi)用自来水过滤,清洗,取回切片。

vii)染色,封固切片。

viii)在低倍显微镜下检查螨虫。

通常的组织学技术可以制备永久封固切片。

阳离子染料是最合适和特效的,因为他们对螨虫染色强,而对气管染色弱。最合适的是1%的亚甲基蓝水溶液,可以先将亚甲基蓝溶解,再加入氯化钠,制成0.85%氯化钠溶液。

试验步骤:

i)用1%亚甲基蓝水溶液染色。

ii)切片在蒸馏水中分化2~5分钟。

iii)切片用70%酒精冲洗。

当用95%酒精保存时,螨可再着色6小时。这种技术的关键是在氢氧化钾溶液中有效浸软组织。使用这种方法可以迅速和方便地处理大量样品。

d)酶联免疫吸附方法

已经研制出诊断气管螨的ELISA方法。这种方法可能会产生假阳性结果,因此只建议用于普查。另一种方法是观察鸟粪素——螨虫的含氮代谢废物。

三、所需疫苗和诊断生物制品

没有可用的生物制品。薄荷醇晶体(50 g可用于一个双层的蜂群)防治螨类只要在蜂群里放置28天,要求环境温度至少18℃。气化的最适温度范围为27~29℃。用氢化植物油(如人造奶油,不含动物脂肪)和白糖制成的小糖饼将螨发病率控制低至10%。糖饼(约100 g重)应在秋季和早春放置在巢箱框梁顶部。甲酸可用于治疗受侵染的蜂群。

蜜蜂的一些品种(系),如布克法斯特蜜蜂(Buckfast bees)和善于清洁的品系,较少受到蜂盾螨的侵染。

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