斑马鱼HO1基因的表达特征及功能研究

陶文庭 王琳琳 侯少丰 李 志 桂建芳 钟雪萍



斑马鱼1基因的表达特征及功能研究

陶文庭1王琳琳1侯少丰1李 志2桂建芳2钟雪萍1

(1. 华中师范大学生命科学学院, 湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室, 武汉 430079; 2. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072)

实验对血红素加氧酶1(HO1)在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示, 斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%—86.8%, 血红素结合标签相似性为87.5%—95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测, 结果显示1转录本母源存在,1mRNA的表达水平在尾芽期前较低, 到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达, 在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现, 注射1 mRNA使1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射1MO使1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,1基因表达抑制可导致1表达量显著下降,1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。

斑马鱼; 血红素加氧酶1; 表达特征; 功能

血红素加氧酶(Heme oxygenase, HO)是血红素降解的起始酶和限速酶, 可代谢血红素形成胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁(Fe2+)。胆绿素被胞内的胆绿素还原酶进一步催化生成胆红素。HO通过催化血红素降解产生的代谢产物在抗氧化、防御细胞凋亡、传递神经元信息和调节血管紧张度等方面发挥重要作用[1-3]。HO在体内有3种同工酶, HO1、HO2和HO3, 分别由不同的基因编码。研究表明, HO2和HO3为结构型, HO1为诱导型。当细胞和组织处于应激状态时, HO1可作为保护性蛋白被诱导, 以防御体内由细胞因子介导的细胞损伤[3-7]。

研究发现, 在产前惊厥和胎儿宫内发育迟缓的人类病人胎盘内HO1水平明显降低[8, 9]。1基因缺失男孩生长发育异常, 伴有贫血、组织性铁沉积、白血病, 并且对氧化损伤的敏感性增加, 直至最后死亡[10, 11]。大鼠体内HO1水平降低也表现出与1基因缺失男孩相似的病理反应[12, 13]。此外, 抑制大鼠胎盘的HO1活性导致胎儿个体显著减小, 妊娠大鼠转染1基因后胎儿的体重明显增加[14]。Homx1-/-鼠仔存活率仅20%, 极少存活到成年的Homx1-/-小鼠个体较对照小。这些结果显示, HO1在人和脊椎动物的发育过程中可能发挥重要作用。

目前, 国内外研究主要探讨了HO1在疾病的发生、发展和临床治疗中的作用, 而其在胚胎发育中的作用机制尚不清楚。斑马鱼具有胚胎体外发育,且胚胎透明的优势, 可直接在体外观察其组织、器官的生长, 且便于基因操作。利用斑马鱼这一理想的发育和遗传研究模型, 可系统地分析1基因的生物学功能。在本文中我们研究了斑马鱼1基因的时空表达特征, 然后通过基因过表达和敲降的方法初步研究了1在斑马鱼胚胎发育中的功能。

1 材料与方法

1.1 HO1的原核表达及多克隆抗体的制备

根据斑马鱼1 cDNA ORF序列设计一对引物1F1和1R1, 在5′端分别加入了I和Ⅰ的酶切位点序列(表1)。以cDNA 为模板, 用高保真酶进行PCR反应, 产物插入表达载体pET-32a, 阳性克隆用IPTG诱导重组蛋白表达。将诱导的蛋白进行SDS-PAGE分析, 用干净的刀片准确切下目的条带, 用生理盐水研磨胶条成稀糊状, 调整好浓度免疫家兔, 间隔免疫4次, 收集血液得到多抗血清。

1.2 RT-PCR和Real-time PCR检测基因的表达

用SV Total RNA Isolation Kit (Promega)提取斑马鱼成鱼各组织和各时期胚胎的总RNA, 具体步骤按照试剂盒说明书进行。取各组织或各时期胚胎RNA, 用逆转录酶Powerscrit和oligo(dT)合成第一链模板cDNA。用各种组织或胚胎的cDNA作为模板进行RT-PCR和Real-Time PCR反应。以斑马鱼基因作为对照。RT-PCR反应条件为: 95℃变性30s; 55℃退火30s; 72℃延伸30s。Real-time PCR体系: cDNA模板1 μL, 10×酶反应buffer 2 μL, dNTP (10 mmol/L) 0.4 μL, 上、下游引物各0.4 μL, SYBR Green I 1 μL,酶0.5 μL, 补ddH2O至20 μL。Real-time RCR循环程序与常规PCR相同, 只是在每一个循环最后要设一个读板温度, 这一般根据目的基因情况而定, 另一个要设的是融链温度分析的梯度温度。每一个样品重复3次, 每个基因的表达量以为参照用2–∆∆Ct方法[15]进行数据处理及分析。

1.3 整体原位杂交

参照斑马鱼的整体原位杂交方法[16]进行。所有杂交所用的溶液和移液管都用DEPC处理。

1.4 斑马鱼HO1 mRNA 体外合成与显微注射

设计一对引物F4和R4 (表1)。以斑马鱼cDNA为模板, PCR扩增1基因的ORF序列。将该序列连接到pCS2+表达载体上, 测序确定其正确性和完整性。重组质粒经Ⅰ单酶切线性化后作为模板, 用Megascript试剂盒(Ambion公司)参照说明书合成Capped1 mRNA。使用显微注射仪(PLI-100, 美国Harvard公司)进行显微注射, 将mRNA注射入1细胞期斑马鱼胚胎的动物极细胞与卵黄的连接处。试验组注射合成的Capped1 mRNA, 每个受精卵大约注射200 pg。对照组胚胎注射双蒸水。实时观察胚胎的表型变化并拍照。

1.5 斑马鱼HO1 Morpholino的合成与显微注射

对1基因的序列进行分析, 采用在翻译水平上进行封闭抑制基因的表达。将1的5′UTR 序列+翻译起始位点ATG之后的一段序列提交至www.genetools.com, 设计并合成1基因的Mor- pholino (5′-TCCATCTTTGTGCTGTAGATGTCCT-3′)及其对照Morpholino (5′-TCCATGTTTCTGCTCTAC ATCTCCT-3′)。于l-细胞期将Morpholino和对照Morpholino注射到受精卵动物极细胞与卵黄的连接处, 每个受精卵大约注射5 ng, 实时观察胚胎的表型变化、拍照并在适当时间收集胚胎。

1.6 Western blotting 检验HO1蛋白的表达

取对照组或显微注射1 mRNA/MO的胚胎。参照斑马鱼胚胎免疫印迹方法[17]进行检测各组HO1蛋白的表达。

1.7 观察、测量和数据统计

显微注射后的斑马鱼胚胎用体视显微镜进行观察、拍照。用ImageJ 4.1软件测量照片上胚胎的体长及头身角(HTA)。组间数据用Origin 6.1软件中-test方法来分析差异显著性。测量数据用Means ± standard error (SE)的图形来表示。当<0.05时认为差异性显著。

表1 实验所用引物

2 结果

2.1 斑马鱼HO1基因的序列同源性以及进化树分析

从NCBI查得斑马鱼的1基因序列。根据DNAstar软件获得DrHO1氨基酸序列, 利用在线软件预测出DrHO1的结构。预测的DrHO1结构与哺乳类HO1结构基本相似, 含有血红素加氧酶结构域(Heme oxygenase domain)和血红素结合标签(Heme oxygenase signature)。用ClustalW进行序列比对, 结果显示DrHO1氨基酸序列与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似度为44.1%—86.8%, 血红素加氧酶结构域相似度为50.2%—88.8%, 结构域中血红素结合标签相似度为87.5%—95.8% (表2)。在目前已经发现的鱼类HO1中, 斑马鱼HO1与CaHO1相似性最高, 为86.8%。用DNAStar构建系统进化树(图1), 发现人和各种动植物的HO蛋白, 按照HO不同的类型严格聚类。斑马鱼的HO1则与其他鱼类的HO1聚集到一个分支上。而各种动物的HO1和HO2聚类在同一个分支上, 较BjHO3同源性更高。

表2 斑马鱼HO1与其他物种HO1的同源性比较

图1 HO家族的系统进化关系

Bj.; Bt.; Ca.; Dl.; Dr.; Gg.; Hs.; Mam.; Mm.; Rn.; Tr.; Xt.

2.2 HO1基因在斑马鱼胚胎以及成鱼各组织中的分布

RT-PCR结果显示,1转录本是母源存在的,1基因的表达水平在尾芽期以前比较低, 从分节期开始上升, 到咽囊期迅速上升到较高水平, 该基因的高水平表达一直持续到胚胎出苗(图2)。用1反义RNA探针对不同发育时期的胚胎进行整体原位杂交实验。WISH结果显示,1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量比较高(图3)。用RT-PCR检测1基因的组织分布, 结果显示1基因在斑马鱼所检测的各个组织中均有表达, 在肝脏、脾、鳃、肾、脑中的表达量较大, 在皮肤和肌肉中也检测到痕量的转录本(图4)。

2.3 超表达HO1基因对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响

将体外合成的斑马鱼1 mRNA 注射斑马鱼胚胎, 使1基因超表达, 观察其表型变化。同时用注射H2O的斑马鱼胚胎作为对照组。采用Western blot检验mRNA的特异性, 发现体外合成的1 mRNA 可以特异增加HO1的表达量(图5A)。实验结果显示, 显微注射1 mRNA, 使1基因超表达后, 斑马鱼胚胎的表型没有明显变化(图5B)。

图2 RT-PCR检测HO1基因在不同胚胎发育阶段的表达特征

1.Unfertilized; 2. 2 hpf; 3. 4 hpf; 4. 6 hpf; 5. 10 hpf; 6. 24 hpf; 7. 36 hpf; 8. 48 hpf; 9. 60 hpf; 10. 72 hpf

图3 WISH分析HO1基因在不同胚胎发育阶段的表达

图4 HO1在斑马鱼组织里的表达特征图谱

1. 心heart; 2. 肝liver; 3. 脾splee; 4. 腮gill; 5. 肾kidney; 6. 脑brain; 7. 精巢testis; 8. 皮肤skin; 9. 肌肉muscle

2.4 敲降HO1 基因导致斑马鱼胚胎发育异常

采用Western blot检验MO的特异性, 发现MO可以特异性地降低HO1蛋白的表达(图6A)。我们用斑马鱼1 的特异 morpholino (1-MO) 注射斑马鱼胚胎, 使1基因敲降。并用斑马鱼1 MO 和体外转录合成的斑马鱼1 mRNA共注射斑马鱼胚胎。同时用注射对照morpholino (Control-MO)的斑马鱼胚胎作为对照组。在体视显微镜下观察24、36和48 hpf各组胚胎表型变化。实验结果表明,显微注射1 MO, 在1基因敲降后, 斑马鱼胚胎较对照发育迟缓, 围心腔水肿。严重畸形的胚胎躯干缩短, 尾部消失。1 MO和mRNA共注射组胚胎表型没有发生明显变化(图6B、C)。敲降组胚胎畸形率和死亡率明显高于对照组, 而共注射组胚胎畸形率和死亡率基本与对照组没有明显差异(图6D)。

取显微注射后48h的胚胎, 利用Real-time PCR 技术, 以11 和1等基因为研究对象, 探讨了1基因敲降对IGF信号通路的影响。结果发现,1基因敲降组斑马鱼胚胎1的表达量较对照组显著下降,1的表达量较对照组显著增加,表达量无显著变化(图7)。

3 讨论

目前有关1基因的研究比较多, 但国内外尚无斑马鱼1基因在胚胎发育中的功能的报道。生物信息学分析表明, 斑马鱼1基因序列具有HO1的主要功能区, 包含保守的血红素加氧酶结构域、血红素结合标签、C端跨膜区(252—271aa)以及5个组氨酸残基(His28、His74、His98、His115、His135)。血红素加氧酶是催化血红素降解的起始酶和限速酶, 血红素结合标签和保守的组氨酸残基有助于血红素结合在血红素加氧酶上, 使血红素加氧酶发挥催化作用。多重序列比对分析发现, 斑马鱼HO1氨基酸序列相对保守, 与小鼠、人、鸡、兔子、斑马鱼、鲫鱼、河豚等1基因的同源性为44.1%—86.8%。斑马鱼1基因血红素结合标签与其他物种的同源性高达87.5%以上。这些分析表明1基因在生物进化过程中具有重要的生物学功能。

图5 斑马鱼HO1基因过表达表型分析

A. 免疫杂交检测注射1 mRNA后HO1的蛋白水平; B.1过表达表型

A. Western blot analysis of1 protein in embryos after1 mRNA injection; B. Phenotype of zebrafish embryos injected with1 mRNA

图6 HO1基因敲降对斑马鱼胚胎发育的影响

A. Western blot检测注射MO后HO1的蛋白水平; B.1敲降胚胎表型; C.1敲降胚胎头身角测量; D. 三种不同表型胚胎的百分比, 白色柱代表正常胚胎, 灰色柱代表畸形的胚胎, 黑色柱代表死亡的胚胎

A. Western blot analysis of HO1 protein in embryos after1 MO injection; B. Phenotype of zebrafish embryos injected with1 MO; C. HTA of zebrafish embryos injected with1 MO; D. Percentage histogram of three phenotypes, including normal (white bar), abnormal (grey bar) and dead (dark bar) embryos

图7 Real-Time PCR检测斑马鱼HO1敲降后IGF1、IGFR1和IGFBP1 的mRNA 水平

HO1在脊椎动物胚胎发育过程中具有明显的时空表达差异和细胞特异性。研究发现, 大鼠个体发生过程中HO1的表达最先出现在怀孕10d大鼠的卵黄囊未成熟巨噬细胞内, 随后出现在胚胎的肝脏巨噬细胞。随着胎儿的发育, 表达HO1的巨噬细胞数目不断增加, 到孕后18d达到顶峰。HO1在胎儿肝、肺、脾、骨髓和其他组织的巨噬细胞, 以及绒毛膜的合胞层细胞、卵黄囊的内胚层细胞、肾小管细胞中也有表达[8-20]。斑马鱼的原位杂交结果表明, 胚胎发育期间斑马鱼1基因在卵黄合胞层、血液和眼中被检测到, 与小鼠的结果非常相似。RT-PCR结果表明, 从未受精卵开始, 即可以检测到斑马鱼1基因的表达, 说明斑马鱼1基因是母源表达基因。母源表达基因可以调控早期胚胎的细胞分裂、细胞分化和合子基因转录的起始。这表明HO1在早期胚胎发育中发挥重要作用。

进一步对斑马鱼1在成体各组织中的表达情况进行分析, 发现1基因在多个组织中均有表达, 表达量有显著的组织差异。1作为早期压力应答基因, 在生理条件下广泛表达。而高水平1的表达主要发生在一些降解衰老红细胞的组织中, 在很多不参与红细胞和血红蛋白转化的组织表达量较低[4]。研究发现在脊椎动物被检测的多个组织中脾内1的含量最高, 其次为肝[21, 22]。1在脑中的表达因物种的不同会有差异。和小鼠脑中1的表达量在所有检测的组织中最低[23]。而我们的结果表明,1基因在斑马鱼多个组织中均有表达, 在肝脏、脾、鳃、肾、脑中的表达量均较大, 仅在皮肤和肌肉中表达量较小。这些结果表明HO1在斑马鱼成年组织器官中可能具有更广泛的生物学功能。

近年来显微注射吗啡啉修饰反义寡核苷酸(MO)阻抑基因表达已被广泛用于研究鱼类目的基因的功能。我们设计的1 MO在靶基因的翻译起始点ATG附近。Western blot结果显示, 显微注射1 MO后HO1蛋白的表达量显著降低, 表明1 MO能有效的阻断1基因的表达。与对照组相比,1 MO注射组胚胎发育迟缓, 围心腔水肿。严重畸形的胚胎躯干缩短, 尾部消失, 且死亡率和畸形率大大增加。1 MO所引起的异常表型可被1 mRNA回复。这一结果表明1基因表达异常可显著影响斑马鱼正常发育。人类和哺乳动物中的研究表明, HO1主要通过增加胎儿胎盘的血流量, 增强胎盘生长因子(如VEGF等)的表达和激活, 从而调节胚胎的早期发育[12, 24—26]。斑马鱼为卵生动物,1基因调节其胚胎发育的方式与哺乳动物不同,1基因可直接调节胚胎各器官的发育。我们的研究发现,1基因表达量降低可影响胚胎生长发育重要调节基因1和1的正常表达, 导致1的表达量较对照组显著下降,1的表达量较对照组显著增加, 表明斑马鱼1 基因可通过调节胚胎IGF信号途径调控胚胎的正常发育。

总之, 斑马鱼1是母源基因, 在斑马鱼胚胎正常发育中发挥重要作用。但目前HO1在斑马鱼胚胎发育中的作用方式和作用机制尚不清楚。本研究为进一步探讨斑马鱼HO1影响斑马鱼早期胚胎发育的机制奠定了基础。

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STUDY ON EXPRESSION PATTERN AND FUNCTION OF ZEBRAFISH1

TAO Wen-Ting1, WANG Lin-Lin1, HOU Shao-Feng1, LI Zhi2, GUI Jian-Fang2and ZHONG Xue-Ping1

(1. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Sciences, Huazhong Normal University, Wuhan 430079, China; 2.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

This paper has studied the function of heme oxygenase 1 (HO1) in the development of zebrafish. Zebrafish1contains heme oxygenase domain, heme binding signature, five histidine residues and hydrophobic segment at carboxyl terminus. Analysis of the deduced amino acid sequences revealed zebrafish1shared 44.1%—86.8% similarity with known sequences from other species. Analyzing embryos of different development stages by RT-PCR showed that zebrafish1 existed in unfertilized eggs. Its level increased from 24hpf and remained a high level expression until 72hpf. The tissue expression pattern analysis showed that zabrafish1 was expressed ubiquitously and the expression in brain, heart, gill and liver was obviously higher than others. Whole-mounthybridization showed that1 transcript exists in yolk syncytial layer, blood and eyes during embyonic development. Using overexpression and knock down technology, we found that over-expression of1 had no apparent effect on the early development of zebrafish. Knocked down of1 gene by1 MO made the embryo development retarded. The abnormality and lethal rates of embryos after MO treatment were significantly increased compared with control. The level of1 and1mRNA changed significantly after1 was knocked down. These results showed that HO1 can regulate of zebrafish embryonic development through IGF signaling.

Zebrafish; Heme oxygenase 1; Expression pattern; Function

2013-04-24;

2014-01-12

国家自然科学基金项目(30972254, 31071997); 淡水生态与生物技术国家重点实验室开放基金(2013FB03)资助

陶文庭(1986—), 湖北武汉人; 硕士研究生; 研究方向为遗传学。E-mail: taowenting929@163.com

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn; 钟雪萍, E-mail: zhongxueping@mail.ccnu.edu.cn

Q344+.1

A

1000-3207(2014)02-0209-07

10.7541/2014.31