饲料中不同浓度菲对中华倒刺鲃几种血液学指标和肝胰脏的影响

岳南南 王 汨 闫玉莲 李 健 罗其勇 谢小军



饲料中不同浓度菲对中华倒刺鲃几种血液学指标和肝胰脏的影响

岳南南 王 汨 闫玉莲 李 健 罗其勇 谢小军

(西南大学生命科学学院, 水生生物及水环境研究所, 重庆 400715)

以中华倒刺鲃()幼鱼[初始体重为(42.80±0.32) g]为研究对象, 在实验室条件下分别饲喂菲(PHE)含量为0、429.17、861.38和1289.87 μg PHE/g的人工配合饲料16周, 测定鱼体的血液学指标以及肝胰脏指数的变化, 以检验中华倒刺鲃受到含PHE食物暴露胁迫后的毒理学反应。结果显示: 血清中的红细胞数目、血红蛋白和总蛋白在各实验处理组之间均无显著差异; 血糖含量随PHE浓度的升高表现出先升高后降低的趋势, 且各染毒组均显著高于对照组(<0.05); 球蛋白含量在500 μg PHE/g组显著高于对照组(<0.05), 白蛋白含量则在500 μg PHE/g组显著低于对照组(<0.05), 而这两个指标在其余含毒饲料组与对照组间均无显著差异; 谷丙转氨酶活力随饲料中PHE浓度的升高表现出升高的趋势,仅在最高浓度组(1500 μg PHE/g组)时与对照组的差异达到显著水平(<0.05); 谷草转氨酶活力也随饲料中PHE浓度的升高而升高, 在1000和1500 μg PHE/g组与对照组之间差异显著(<0.05); 肝糖原随饲料中PHE浓度的升高而降低, 且各组间的差异均达到了显著水平(<0.05); 各实验处理组的肌糖原含量均显著低于对照组(<0.05), 而3个染毒饲料组之间无显著差异; 肝胰脏指数随饲料中PHE浓度的升高而升高, 且各染毒组显著高于对照组(<0.05)。通过讨论我们认为: 中华倒刺鲃受到含PHE食物胁迫后血糖升高, 而糖原含量和血清蛋白降低的现象应当是动物受到胁迫后能量需求升高的适应性反应, 肝胰脏指数的升高是鱼体对PHE食物暴露胁迫在器官水平上的代偿性反应, 而两种转氨酶在有毒饲料处理组鱼体的升高则表明PHE对肝脏造成了细胞损伤。

多环芳烃; 饲料菲; 中华倒刺鲃; 血液学指标; 糖原; 肝指数

水环境中的多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)因其持久性和致癌、致畸、致突变性质对鱼类产生严重的生态毒理学威胁[1]。在水环境中的多环芳烃作为疏水有机化学污染物会迅速与水中各类固体微粒结合进入沉积物, 被底栖生物所利用[2], 进而进入鱼类的食物链, 给鱼类带来生理上的威胁。一些研究表明PAHs暴露会对鱼类的血液参数带来不利的影响[3—8], 而鱼类血液学参数可以反映内分泌应答。Omoregie,.[9]发现当鱼体遭受环境污染物胁迫时表现为代谢能力的升高和显著的血糖反应, 血清中皮质醇水平和碳水化合物代谢的变化(如血糖和乳酸的浓度), 可作为鱼类受到环境有害因子胁迫的指示物[10,11]。

中华倒刺鲃()是长江上游重要的经济鱼类[12]。近年来, 由于人们对该种鱼的过度捕捞, 使得野生资源逐渐匮乏[13, 14], 随着人工繁殖和鱼苗培育的成功, 中华倒刺鲃人工养殖已逐渐展开, 成为淡水养殖业的重要养殖对象之一。菲(C14H10, PHE)是一种低环类多环芳烃, 由3个苯环连接而成, 具有较强的毒性[15], 我国一些水域已发现有不同程度的污染[16—18]。目前, 国内有关菲对鱼类毒理学影响的研究较少, 只在鱼体繁殖行为[19]和器官组织结构[20]等方向有少数研究, 有关其对血液学和应对胁迫时能量储备变化的研究较少。本文通过菲对中华倒刺鲃的室内食物暴露实验来模拟野外水域中不同浓度的菲通过食物途径对中华倒刺鲃血液学和肝脏等的影响, 以补充菲对鱼类的生态毒理作用的基础资料, 为阐明水环境中多环芳烃的污染提供参考。

1 材料与方法

1.1 饲料配制

对照饲料: 参照林小植等[21]的方法配制中华倒刺鲃实验饲料, 其配方见表1。在对照饲料中添加一定量的PHE (美国Sigma-Aldrich公司生产,CAS号为85-01-8, 纯度≥97%)配制成含PHE量分别为0、500、1000和1500 μg PHE/g的4种处理饲料, 采用Agilent 7890A GC型气相色谱仪检测饲料中PHE的浓度[18], 实测实验处理饲料含PHE浓度分别为0、429.17、861.38和1289.87 μg PHE/g。采用自制颗粒饲料制作器压制成每粒相同重量的饲料[22—23], 配制成的颗粒饲料呈圆柱状, 每颗粒的直径为4 mm, 高为6 mm, 每粒质量控制为(0.096±0.001) g, 饲料配制好后, 置于–20℃冰箱中保存备用。

1.2 实验鱼的来源与驯化

实验鱼为购自合川养殖场同批次人工繁殖的中华倒刺鲃幼鱼。挑选体重相近, 体表无伤的幼鱼放入室内循环水养殖系统的养殖箱中, 单尾驯养2周。采用曝气48h的自来水为实验水源, 水温控制为(27.5±0.5)℃; 驯养期间以对照饲料为驯化饲料, 每天8:30和18:30各投喂一次达饱足。每2天换水一次, 实验期间溶氧量大于6 mg/L, 光照周期为L︰D=12h︰12h, 每天8:00开灯, 20:00关灯, 瞬时开断。

1.3 实验鱼的分组

选取经驯化后体重相近(39.65—45.64 g), 均值为 (42.80±0.32) g的中华倒刺鲃幼鱼, 随机分为4组, 每组10尾鱼(初始体重见表3), 单尾养殖于养殖水箱(规格为: 长×宽×高=42 cm×29 cm×25 cm)中。采用4个不同浓度的含PHE饲料(0、429.17、861.38和1289.87 μg PHE/g)分别喂养16周, 通过统计每尾鱼摄食的颗粒数来计算摄入的饲料总量。

表1 实验饲料配方及成分含量表(%干重)

Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diets (% dry weight)

注: 1. 维生素预混剂 Vitamin premix (IU or mg/kg diet): DL-alphatocopheryl acetate, 60 IU; Namenadione bisulfate, 5 mg; Retinyl acetate, 15000 IU; DL-choleealcifeol, 3000 IU; B1, 15 mg; B2, 30 mg; B6, 15 mg; B12, 0.05 mg; Nieotinic acid, 175 mg; Folic acid, 500 mg; Inositol, 1000 mg; H, 2.5 mg; Calcium pantothenate, 50 mg; Choline, 2000 mg; C, 270 mg; 2. 无机盐预混剂 Mineral premix (g or mg/kg diet): CaCO3(40% Ca), 2.15 g; MgO (60% Mg), 1.24 g; FeC6H5O7·H2O, 0.2 g; KI (75% I), 0.4 mg; ZnSO4(36% Zn), 0.4 g; CuSO4·5H2O (25% Cu), 0.3 g

1.4 各项指标测定及计算方法

每次取样前测量记录实验鱼的体重、体长、全长、肝胰脏重等常规生物学指标。以浓度为0.04 g/L的氟化钠、草酸钾混合液作为抗凝剂[氟化钠(g)︰草酸钾(g)=1︰3], 在取样前用注射器在离心管中各加入0.1 mL, 使其分散于内壁, 70℃烘干备用。取样时, 将实验鱼用湿毛巾包裹固定, 用1.0 mL一次性医用注射器通过尾静脉抽血, 血样保存在1.5 mL抗凝的离心管中, 整个采血过程控制在1min以内。

血红蛋白含量(Haemoglobin, Hb)采用碱化比色法测定; 以0.7%的生理盐水将血液稀释200倍, 用Neubarner计数板在显微镜下对红细胞 (Red blood cell, RBC) 计数[24]; 剩余的血液在冰盒中静置2h, 然后在冷冻离心机中以5000 r/min离心10min, 静置分层吸取上层血清于–80℃下保存待测。

血清葡萄糖浓度(Glucose concentration, GLU)采用邻甲苯胺法测定[25]; 血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)和血清谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)活力采用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒及提供的方法测定; 总蛋白(Total protein, TP)含量采用酚试剂法测定; 白蛋白(Albumin, ALB)含量采用溴甲酚绿结合法测量; 球蛋白(Globulin, GLB)=总蛋白含量–白蛋白含量。

肝胰脏糖原(Hepatopancreas glycogen, HG)含量的测定: 在实验结束后, 将鱼体处死, 迅速取出肝胰脏用预冷的匀浆缓冲液(0.7%的生理盐水)冲洗, 用滤纸除去多余液体后, 装入1.5 mL离心管, –80℃保存待测。肝胰脏糖原含量采用蒽酮显色法测定[26], 其含量以mg/g表示。

肌糖原(Muscle glycogen, MG)含量的测定: 在实验结束后, 将鱼体处死后迅速取出肌肉, 用滤纸除去多余水体后, 装入5 mL离心管, –80℃保存待测。肌糖原采用碱性铜显色法测定[27], 其含量以mg/g表示。

肝胰脏指数(Hepatopancreas index,)的计算方法:

=100×h/t,其中t为鱼体重(g),h为肝胰脏重(g)。

1.5 数据处理方法

采用Excel 2003和SPSS 11.5软件进行数据整理及统计分析。各组间比较采用单因素方差分析和LSD检验, 显著性水平为<0.05, 数据表示为平均值±标准误。

2 结果

2.1 中华倒刺鲃的血液学指标随其饲料中菲(PHE)浓度的变化

实验鱼体血清中的红细胞数目(RBC)、血红蛋白(Hb)和总蛋白(TP)在各实验处理组之间均无显著差异(表2); 血糖(GLU)含量随饲料中PHE浓度的升高表现出先升高后降低的趋势, 且各染毒组均显著高于对照组(<0.05), 1000 μg PHE/g组的GLU含量最高, 为(17.33±1.28) mmol/L(表2)。球蛋白(GLB)含量随饲料中PHE浓度的增高表现为先升高后降低, 500 μg PHE/g组达最高, 为(16.98±1.55) g/L (表2), 显著高于其他3组(<0.05), 其余各组与对照组之间无显著差异。500 μg PHE/g组的白蛋白(ALB)含量显著低于其他各组(<0.05), 为(24.79±1.86) g/L, 而其余各组间均无显著差异。

表2 饲料PHE含量水平对中华倒刺鲃血液学指标的影响

注: 数据用平均值±标准误表示(mean ± SE,=10), a, b, c: 同行中带不同上标表示不同浓度饲料组之间差异显著(<0.05); 下同

Note: Data were expressed as mean±SE,=10; a, b, c: different superscripts in each line indicate significant differences among dietary treatments (<0.05); the same applies bellow

实验鱼的谷丙转氨酶活力(ALT)随饲料中PHE浓度的升高表现出升高的趋势,但仅在最高浓度组(1500 μg PHE/g组)时显著高于对照组(<0.05), 为(163.59±18.83) μ/L (表2)。谷草转氨酶活力(AST)随饲料中PHE浓度的升高表现出升高的趋势, 其中500 μg PHE/g组与对照组之间无显著差异, 此两组的该值均显著低于1000和1500 μg PHE/g组(<0.05); 而后两者之间无显著差异(表2)。

2.2 中华倒刺鲃的肝胰脏指数(HSI)随其饲料中菲浓度的变化

实验鱼的肝胰脏指数()随饲料中PHE浓度的升高而升高, 0、500、1000和1500 μg PHE/g饲料组实验鱼的分别为(2.18±0.10)、(2.90±0.94)、(3.25±0.05)和(3.92±0.19)%(表3)。方差分析显示, 各含毒饲料组均显著高于对照组, 500和1000 μg PHE/g组之间差异不显著, 但二者均显著低于1500 μg PHE/g组(<0.05)。

表3 饲料PHE含量水平对中华倒刺鲃肝糖原、肌糖原以及肝胰脏指数的影响

Tab.3 Effects of different dietary PHE levels on the contents of glycogen in hepatopancreas and muscle and the Hepatopancreas index of Spinibarbus Sinensis

2.3 中华倒刺鲃的肝胰脏糖原(HG)、肌糖原(MG)含量随其饲料中菲浓度的变化

实验鱼的HG含量随饲料中PHE浓度的升高而降低, 0、500、1000和1500 μg PHE/g饲料组实验鱼的HG含量分别为(46.44±2.00)、(37.09±1.53)、(20.77± 0.48)和(15.16±1.63) mg/g, 且各组间的差异均达到了显著水平(<0.05)(表3); MG含量分别为(2.52± 0.15)、(2.11±0.09)、(2.02±0.09)和(2.03±0.06) mg/g, 各染毒饲料组的MG含量均显著低于对照组(<0.05), 而3个染毒饲料组之间无显著差异(表3)。

3 讨论

3.1 饲料PHE暴露(Dietary PHE exposure)对中华倒刺鲃血液学指标的影响

环境中的多环芳烃(PAHs)对鱼体的多项代谢功能产生不利影响, 血液参数的变化可以反映环境PAHs污染物的毒性损伤[3]。黄鳝()暴露于含硫丹(Endosulfan)的水体中96h后发现其RBC、Hb与对照组相比均显著降低, 而TP无显著变化[4]。牙鲆()暴露于含PHE的水体中后, 发现其RBC和Hb随暴露时间的延长而降低[5]。PHE是PAHs类化合物中对鱼体毒性较强的物质, 但本研究发现, PHE食物暴露16周后中华倒刺鲃的RBC、Hb和TP在各组之间均无显著差异。而大西洋鲑鱼()暴露于含硫丹的饲料中49d后其Hb也与对照组无显著差别[3]。上述两类实验结果表现出PHE水体暴露对鱼体血液学指标的影响要大于食物暴露的倾向, 但这是否确为造成这种差异的原因还应当进行比较实验予以检验。

已有研究发现大鳞大麻哈鱼()暴露于含PAHs的饲料后其白蛋白和总蛋白均有降低的趋势[6]。本研究发现白蛋白含量在500 μg PHE/g饲料组(24.79±1.86) g/L显著低于其他组, 达到最小值; 而球蛋白含量在500 μg PHE/g饲料组显著高于其他组, 达到最大值。沈竑等[7]研究铜对鲫鱼()血液的影响时发现, 在低浓度Cu2+暴露时, 促进肝脏球蛋白合成代谢而导致球蛋白含量升高, 在高浓度Cu2+暴露时, 虽然刺激肝脏合成球蛋白, 但免疫系统可能受损, 从而使球蛋白减少; 这与本结果球蛋白含量随PHE浓度的增高表现为先升高后降低的趋势相似。

3.2 中华倒刺鲃应对饲料PHE暴露污染胁迫的能量代谢反应

已有研究报道, 鱼体暴露于PAHs后, 其血清代谢物会发生变化, 例如血糖和血乳酸的升高[8, 28]。鱼体暴露于萘(Naphthalene)等其他PAHs后也会产生血糖升高的代谢胁迫反应[29—33]。本研究发现, 各染毒组中华倒刺鲃的血糖水平均显著高于对照组。Dange[29]提出鱼类受到污染胁迫后会产生高糖血症的现象具有普遍性, 并认为血糖升高的现象是由于糖原储备的耗用而引起的。结合本实验中肝糖原水平的下降, 可以推测由于中华倒刺鲃在受到PHE污染胁迫时肝脏糖原大量分解进入血清, 使血糖的浓度升高而有利于鱼类调动能量进行解毒或者代谢有毒物质。这进一步验证了肝糖原的分解与维持血糖浓度、保证内环境的稳定直接相关[20]。

当鱼体暴露于污染物中时, 体内的碳水化合物代谢会受到干扰[34], 鱼体肝脏通常被认为是外源性物质代谢的主要器官[35]。肝脏合成排毒酶抵抗污染胁迫也需要消耗能量[36]。Tintos,.[33]提出, 当鱼类受到β-萘黄酮(β-NF)和苯并a芘(B[a]P)的胁迫时首先消耗碳水化合物提供能量, 同时调节皮质醇分泌升高, 促进糖原加速分解为葡萄糖进入血清, 引起肝脏糖原和肌肉糖原含量下降, 并使血糖升高或维持在一个较高的水平。鱼体通过提高代谢以加快排泄芳香烃, 因而要分配大量的能量来求得自身平衡而不是进行储存[37], 这些应急性生理机制都将导致糖原储备的降低。虹鳟() 腹腔注射β-萘黄酮(β-NF)和苯并a芘(B[a]P)、革胡子鲶()暴露于汽油、蟾胡子鲶()和印度囊鳃鲶()暴露于工业污水, 其肝脏中糖原水平均明显下降[32, 33, 37, 38]。本研究也观测到中华倒刺鲃受到含不同浓度PHE食物的毒性胁迫后肝糖原和肌糖原与对照组相比均显著下降, 与前人相关研究发现的情况相一致。

Hori,.[36]指出能量动员发生在肝脏中比在肌肉中更明显, 本研究发现肝糖原含量随食物中PHE浓度的升高而降低, 且各处理组之间的差异显著; 而肌糖原含量在3个毒物浓度处理组均显著低于对照组, 但是3个浓度组之间无显著差异(表3)。我们的发现支持Hori,.[36]的观点。

本实验室关于PHE食物暴露影响中华倒刺鲃能量代谢的观测曾发现, 标准体重代谢率和肝胰脏组织线粒体代谢耗氧率随着饲料中PHE含量的升高而升高[18], 因此我们认为中华倒刺鲃受含PHE食物胁迫后出现血糖升高, 肝胰脏和肌肉糖原降低, 血清蛋白降低等现象反映了鱼体受到胁迫后能量需求升高的适应性调节机制。

3.3 饲料PHE暴露对中华倒刺鲃肝脏功能的影响

肝脏是鱼体内受PAHs毒害最敏感的靶器官之一[40—42]。PAHs可以诱导肝脏代谢和转氨能力的提高[31, 39, 43], 以及抗氧化系统以及解毒能力的增强[44—46]。血清中转氨酶的活力常被用作人类和动物肝功能的诊断工具[35, 47]。细胞外液或血清中转氨酶活性的升高可以作为细胞损伤的敏感指示物, 即使这些损伤很细微, 细胞内这些酶的水平也会超过细胞外液中的水平而多达3个数量级[48]。在蓝鳃太阳鱼()暴露于含PAHs的水体中时观察到ALT的升高, 同样在鲤鱼()暴露于含溴氯菊酯(Decamethrin)的水体中和比目鱼()腹腔注射PAHs后都观测到了相似的现象[49—51]。斑马鱼()暴露于含PHE的水体中后发现受试鱼的肝细胞发生肿大, 胞质产生空泡, 表明其对斑马鱼造成了肝组织损伤[20]。本研究发现中华倒刺鲃AST和ALT均随浓度的升高而升高, 这说明摄食含PHE饲料已经对中华倒刺鲃的肝脏造成了细胞损伤。

鱼类肝指数()的变化常被用来作为鱼类受到污染胁迫时的指示物[52]。有研究表明肝脏指数的升高可以表征肝脏的代谢能力提高[53],与肝脏的解毒能力增强有关[54]。Pinkney,.[52]发现在鱼体中与PAHs的代谢物水平呈正相关。青鳉()暴露于含19.2 mg/L的PHE水体中时出现了肝指数升高的现象[55]。中华倒刺鲃的肝脏与胰脏器官呈弥散型结构, 其肝胰指数的变化可反映肝脏的生理状态。在本实验中中华倒刺鲃肝胰脏指数随暴露浓度的升高而逐渐升高, 即肝胰脏出现肿大, 可能是鱼体应对长期饲料PHE暴露胁迫的一种代偿性反应。

综上所述, 在本实验条件下, 中华倒刺鲃饲料添加不同浓度的PHE, 干扰了血糖、肝糖原及肌糖原等能量储备的正常代谢, 并对肝胰脏造成细胞损伤。

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Effects of dietary PHE exposure on the haematological indexes and hepatopancreas of

YUE Nan-Nan, WANG Mi, YAN Yu-Lian, LI Jian, LUO Qi-Yong and XIE Xiao-Jun

(Institute of Hydrobiology and Water Environment, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China)

To investigate the ecotoxicologial effectsof dietary phenanthrene (PHE) to the juvenile(42.80±0.32 g), these fish were exposed to dietary PHE at different concentrations (0, 500, 1000 and 1500 μg PHE/g) for 16 weeks. The haematological indexes and the hepatopancreas indexwere utilized to measure the ecotoxicologial effectsof dietary PHE. The results showed that the addition of PHE at different concentrations had no significant effects in the number of red blood cells, hemoglobin and total protein in the serum. PHE increased the glucose level with a concentration dependent pattern. 500 μg PHE/g significantly enhanced the globulin and the albumin level compared with control group; however, the higher PHE at 1000 and 1500 μg PHE/g had no significant effectscompared with the control. PHE induced the activity of alanine aminotransferase with a concentration-dependent method, and the significant difference was observed when PHE is at 1500 μg PHE/g (<0.05). PHE also enhanced the activity of aspartate aminotransferase, and the significant effects were observed at the groups of both 1000 and 1500 μg PHE/g. PHE at all different levels significantly decreased the content of glycogen in hepatopancreas(<0.05). PHE decreased the muscle glycogen in the three groups but not significant. PHE dramatically and significantly enhanced the hepatopancreas (<0.05). These results suggest that increasing glucose content and decreasing of glycogen and protein content might be an adaptive response to meet the energy demand for resisting the PHE stress, which might compensated by the increasing hepatopancreas index, and that PHE might damage theliver cells supported by the increasing activities of the two aminotransferases.

Polycyclic aromatic hydrocarbons;; Dietary phenanthrene; Hematology indexs; Glycogen; Liver index

2013-04-23;

2013-12-27

重庆市自然科学基金重点项目(cstc2013jjB80008); 中国长江三峡集团公司科研基金项目(编号: CT-11-08-01)资助

岳南南(1988—), 男, 山西晋城人; 硕士研究生; 主要从事鱼类生理生态学研究。E-mail: 376497280@qq.com

谢小军, E-mail: xjxie@swu.edu.cn

S965.1; X171.5

A

1000-3207(2014)02-0304-08

10.7541/2014.44