沾化冬枣茎尖培养快繁技术研究

尹魁林　 张琼　 孙承烨

摘要 [目的]研究沾化冬枣离体培养的快速繁殖方法。[方法]以沾化冬枣茎尖为材料，以MS基本培养基，添加不同浓度IAA和6BA进行离体培养及再生体系研究，优选最佳培养条件。[结果]外植体最适取材时间为4月下旬，接种培养基为MS+2.5 mg/L GA3；最适增殖培养基为：顶芽切段繁殖MS+0.5 mg/L 6BA+0.25 mg/L IAA，芽丛分割繁殖MS+0.5 mg/L IBA+2 mg/L ZT；最适生根培养基为1/2 MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA；试管苗移栽的最适基质为蛭石加草炭（1∶1，V/V），成活率可达78.8%。[结论]该方法优选了沾化冬枣离体培养的快速繁殖方法，为沾化冬枣的种质资源研究提供了可靠依据。

关键词 沾化冬枣（Ziziphus jujuba Mill）；茎尖；组织培养；离体快繁

中图分类号 S665.1 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）08-02269-02

Study on Rapid Propagation Technology of Zhanhua Brumal Jujube Stem Tip Culture

YIN Kuilin et al （Winter Jujube Institute of Zhanhua County， Binzhou， Shandong 256803）

Abstract [Objective] In order to explore the method for rapid propagation of Ziziphus jujuba Mill in vitro. [Method] With stem apex of Z. jujuba as material， MS as basic culture medium added with IAA， 6BA for in vitro culture， the regeneration system was studied. [Result] The most suitable time for explants is in late April， inoculation medium is MS+GA32.5 mg/L； the most suitable medium for bud proliferation： Cutting propagation of the terminal bud is MS+0.5 mg/L 6BA+0.25 mg/L IAA，bud segmentation propagation is MS+IBA 0.5 mg/L+ZT 2 mg/L； the most suitable medium for rooting is 1/2 MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA；The optimum matrix of plantlets is the vermiculite and peat （1∶1， V/V）， the survival rate can up to 78.8%.

Key words Ziziphus jujuba Mill； Stem tip； Tissue culture； Rapid propagation in vitro

沾化冬棗（Ziziphus jujuba Mill）是我国枣树资源中稀有名贵的鲜食品种，以无与伦比的口感品质，在全国具有较高的知名度和影响力[1]。近年来，随着全国对沾化冬枣引种栽培和推广工作的进行，生产上对优质沾化冬枣苗的需求量急剧增加，利用茎尖组织培养技术是取得大量无病毒优质苗木的一种有效方法[2-4]。为此，笔者对沾化冬枣茎尖培养快繁过程中的诱导分化、增殖、生根、移栽等技术环节进行研究，以期为沾化冬枣的种质资源研究提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料 供试品种为沾化冬枣，经鉴定为Ziziphus jujuba Mill；外植体为枣头顶端主芽（茎尖）。

1.2 方法

1.2.1 无菌培养苗的建立。于4月下旬～5月上旬，在沾化冬枣春季芽刚开始萌发时，选取无病虫害的优良单株上生长旺盛的顶芽（即茎尖），将其茎尖剥去外部苞片（保留约1 cm）放入消毒瓶中，先用70%酒精漂洗30 s，然后用刚配好的5%次氯酸钠溶液消毒4～8 min，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒3～5 min，消毒过后再用无菌水反复冲洗4～5次，而后接种到诱导培养基上，在暗培养3～5 d后转入光培养，待7～14 d开始变绿和生长后，就可转移到试管苗增殖培养基中。随后通过切段繁殖或芽丛分割繁殖方法，经过4～6代增殖培养，即可形成一定数量的试管苗，将高约1.5 cm以上的健壮嫩苗转入生根培养基中培养，约7 d即可看到根原基分化出来，20 d左右可长出3～5条1.5～2.5 cm的细白主根和侧根。

1.2.2 培养条件。基本培养基为MS；琼脂5.10～5.25 g/L；蔗糖20～30 g/L；pH值6.2～6.4；光照强度1 500～2 000 lx；光照时间为16 h/d；培养温度20～25 ℃；空气相对湿度40%～70%。

1.2.3 试管苗移栽。当试管苗长到3～5片叶，并生有2～5条长1 cm以上白根时，即可进行光培炼苗。将生根瓶移入温室中3～5 d，增加光照强度，而后打开瓶盖通风、透气，炼苗2～3 d后，从瓶中取出幼苗，用温水将附着在根上的培养基洗净，然后移栽入装有基质的广口花盆中，加盖玻璃板并遮光或直接放在有遮阳网的小拱棚中，开始几天保持空气相对湿度90%以上，温度控制在18～25 ℃，7 d后增加通气。为了促进生长，其间浇2～3次1/10的MS培养液。待小苗过渡生长1个月左右，即可形成完整的根系，并伴随长出4～5片新叶，则将苗移入田间苗圃中。

2 结果与分析

2.1 外植体的诱导发芽 试验结果表明，沾化冬枣在无激素培养基上（即MS不加激素）能够很好地分化，成活率较高，为78.9%。如果MS培养基中附加2.5 mg/L的GA3，则分化更好些，成活率为82%。一般接种的外植体枣芽在暗培养3～5 d后转入光培养，7～14 d开始变绿和生长，此时则可转移到试管苗增殖培养基中。

2.2 试管苗的增殖培养

2.2.1 试管苗顶芽生长后切段繁殖。沾化冬枣试管苗一般芽分化比较困难，侧芽也很难萌发，往往形成单一的嫩梢，在MS+0.5 mg/L 6BA+0.25 mg/L IAA和MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L IAA以及MS+2 mg/L 6BA+0.1 mg/L IAA这3个培养基上都能够较好地生长，进行切段繁殖后，增殖系数为2.5～3.0。如果在这3个培养基中再加入有机营养酪朊水解物（LH）200 mg/L，则试管苗正常生长和增殖，并可起到壮苗的作用，切段增值系数为2.8～3.0，表现植株生长快而且健壮，叶色较绿。试验中还发现，切段繁殖也可以在生根的试管苗上进行1～2次后，待侧芽萌发0.5～1.0 cm后再移栽更好。因为试管苗基部木质化程度较高，根生长好，移栽成活率高。

2.2.2 芽分化后分割繁殖。为了使试管苗基部分化出新的不定芽和侧芽，以便进行分割繁殖来提高增殖系数，试验制作了4个不同的增殖培养基配方，并采用茎尖（即顶芽）、基部愈伤、茎段以及带柄叶片4种不同组织进行沾化冬枣试管苗增殖试验。放冰箱经低温处理（从冰箱经低温处理的苗，腋芽启动率高，生长整齐）。

由表1可知，以茎尖作材料时，4个培养基中其基部腋芽及顶部腋芽均能起动，1号、2号培养基长速相当，长势较差；其中1号培养基腋芽生长较细，3号培养基出現顶部腋芽较早且较多，4号培养基最好，基部及顶部腋芽起动率高达82%，形成丛生芽，且长速快、整齐，主茎粗壮，腋芽较细但利用率高。以基部愈伤作材料时，除在4号培养基上个别基部腋芽稍有起动外，1号、2号和3号培养基均未起动。以茎段作材料时，1号、2号培养基腋芽起动率低，长速慢，不整齐，节间短但粗壮，平均转苗期为30 d，3号培养基较成功，长得粗壮，平均转苗期为25 d，4号培养基最好，腋芽起动率高，长势整齐，主茎粗壮。以带柄叶片作材料时，4个培养基中均无腋芽起动，叶子纵向卷曲变大。

2.3 试管苗的生根培养 由表2可知，冬枣试管苗生根培养基为4号培养基，如果将培养到2～3叶一心的试管苗剪断接种到此培养基中，在20 ℃左右的光培养室中培养到20 d可以生根，生根率在95%以上，平均单株生根3.5条。但在同样的条件下，以2～3片叶的试管苗，接种到1号、2号、3号培养基中，培养20 d后虽然能生根，但生根率低，不整齐，一般在75%。为了培养壮苗，在生根培养基中加入200 mg/L LH的有机营养物质（即5号培养基），使苗茎粗壮，叶色浓绿，试管苗生根良好，生长势强，平均单株生根3.5条。

2.4 试管苗的移栽 由表3可知，移栽的基质不同，移栽成活率差异较大。将冬枣试管苗移栽到透气、疏松和透水保水良好的基质中，成活率明显高于透气性差易板结的基质。用1号、4号和6号等基质虽然移栽成活率较高，但后期长势欠佳，若用5号基质移栽后长势越来越优于其他基质，表现为植株茎杆粗壮，叶色深绿，进行田间第2次栽植成活率高。因此，认为5号基质是冬枣试管苗过渡移栽的最适基质。为了促进生长，移栽后待幼苗长出幼根和新叶后，对盆内基质追施2～3次1/10的MS大量元素营养液。

移栽时期最好在春季3～5月，温度在20 ℃左右，此时移苗成活率高达80%以上，且枣苗生长旺盛。移栽方法可选用穴盘培养，即每穴种1棵试管苗，将蛭石加草炭（1∶1，V/V）预先装入穴盘内，种植苗后放在有弥雾装置和遮阳网的小拱棚内，棚内的空气相对湿度控制在90%以上，1周后定时进行通风。待从穴盘移入大田时，试管苗的根系在穴盘内生长盘根错节，移苗时连同基质一起种入田间，第2次移栽的成活率一般都在98%以上。