硫链丝菌素诱导非小细胞肺癌细胞自噬性死亡＊

邹争志，聂培培，倪艺榕，周小明*

(1.华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所，暨激光生命科学教育部重点实验室，广东 广州 510631;2.广州金城医学检验有限公司，广东 广州 510631)

硫链丝菌素(Thiostrepton)，又称作硫链丝菌肽，是一种提取自链霉菌的天然抗生素，属于噻唑类抗生素，具有广谱的抗革兰氏阴性与阳性细菌的作用，在兽医中常作为抗乳腺炎药物使用。2008年，首次作为癌基因FoxM1抑制剂及蛋白酶体抑制剂在乳腺癌中的研究而备受关注［1］。近几年，Thiostrepton作为一种抗肿瘤的新药受到广泛研究，发现Thiostrepton主要通过抑制FoxM1的表达及抑制蛋白酶体活性，表现出在体内外均具有显著的抗肿瘤作用［2］。最近研究表明Thiostrepton通过靶向FoxM1蛋白及蛋白酶体而诱导乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞的凋亡，在应用于肿瘤的治疗中具有潜在的价值［3-7］。在乳腺癌中的研究报导，Thiostrepton除了通过靶向FoxM1蛋白抑制乳腺癌细胞的增殖活性［3］，最近发现它能增强耐顺铂的乳腺癌细胞对顺铂的敏感性［8］，与蛋白酶抑制剂Bortezomib联合作用于三阴乳腺癌细胞具有显著的协同效应［9］。在其他肿瘤中的研究发现，Thiostrepton对黑色素瘤细胞有显著的抗肿瘤活性，而对良性的黑色素细胞抑制作用不明显［10］。在B细胞淋巴瘤的研究中发现，Thiostrepton通过靶向FoxM1诱导B细胞淋巴瘤的凋亡并抑制其转移［11］。在间皮瘤中，Thiostrepton通过靶向Peroxiredoxin 3诱导肿瘤细胞凋亡［12］。

自噬(autophagy)是溶酶体对细胞内的部分细胞质、细胞器等进行一系列降解过程的统称。形态学上表现为细胞内出现大量包裹着胞质和细胞器的具有双层膜的吞噬泡。自噬在肿瘤细胞凋亡中具有双重的作用。近年来越来越多的研究表明，细胞自噬与细胞死亡的关系取决于细胞类型及细胞所处的环境。自噬即可以通过促进凋亡而促进细胞死亡，又可以不通过凋亡而直接导致细胞死亡，其中不经过凋亡直接诱导的细胞死亡习惯上被称作自噬性程序性细胞死亡，也叫Ⅱ型程序性细胞死亡［13］。在能量和营养缺乏等条件下，细胞通过自噬降解胞内多余的蛋白质而为细胞提供营养和能量以拯救细胞。由于自噬与细胞死亡之间存在着联系，许多学者开始把自噬作为诱导肿瘤细胞死亡的靶点进行研究。

本研究中，我们发现Thiostrepton显著抑制了非小细胞肺癌PC-9细胞的活力。利用荧光显微镜和免疫印迹技术，我们发现Thiostrepton同时也诱导了PC-9细胞自噬的发生。进一步研究发现当Thiostrepton诱导PC-9细胞的自噬被抑制时，细胞的死亡明显减少。

1 材料与方法

1.1 材料

Thiostrepton、MTT、3-甲基腺嘌呤 (3-Methyladenine，3-MA)、DMSO 购买于 Sigma公司。LC3、p62和GAPDH抗体购买于Cell Signalling Technology公司。凋亡检测试剂盒购买于Invitrogen公司。

1.2 细胞培养

人非小细胞肺癌细胞系PC-9(购于中科院上海细胞库)，培养在明胶铺底的塑料培养瓶，采用含10%胎牛血清(hyclone)的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中常规培养。

1.3 自噬特异性抑制实验

细胞接种到六孔培养板，待细胞贴壁后，3-MA用PBS溶解，储存浓度为100 mmol/L，其冷却时有沉淀，使用前加热使之溶解。3-MA联合Thiostrepton处理组，3-MA在加Thiostrepton处理前预处理1 h，使3-MA终浓度为5 mmol/L，再与Thiostrepton共同作用不同时间，3-MA处理组只加3-MA(终浓度5 mmol/L)，相应体积的DMSO处理组作为空白对照组。

1.4 免疫印迹

将实验处理过的细胞用胰酶消化收集，用预冷的PBS洗三遍，加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1 mmol/L Na3VO4，100 mmol/L PMSF)在冰上裂解30 min，离心，收集上清蛋白液。采用10%-15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜，转膜完成后，用5%脱脂奶粉液封闭，之后分别孵育一抗和二抗。ECL发光显色。

2 结果

2.1 Thiostrepton抑制PC-9细胞活力

本研究中，我们选取了 0、1、2、4、8 μmol/L 的Thiostrepton作用于肺癌细胞PC-9，在分别作用细胞24和48 h后，完成MTT实验，结果表明(图1所示)，随着药物浓度的增加，细胞的活力显著降低。在24 h，与对照组比较，1、2、4、8 μmol/L 的 Thiostrepton处理组细胞平均生长抑制率分别为13.9%、25.9%、40.2%、50.5%。在 48 h，与对照组比较，1、2、4、8 μmol/L的Thiostrepton处理组细胞平均生长抑制率分别为 23.8%、35.4%、62.7%、70.6%。上述结果表明，随着Thiostrepton浓度的增加，PC-9细胞的活力被抑制的越明显，表明Thiostrepton对PC-9细胞的抑制具有剂量依赖性。并且我们也发现在同一浓度下，48 h细胞的抑制率显著高于24 h，表明Thiostrepton抑制PC-9细胞的活力具有时间依赖性。

2.2 Thiostrepton诱导PC-9细胞自噬

在PC-9细胞被Thiostrepton作用后，通过在高倍显微镜下观察，我们发现细胞内有小泡的出现，因此这提示我们可能Thiostrepton能够诱导细胞自噬的发生。因而我们检测了自噬标志蛋白LC3I/II和p62去验证是否Thiostrepton能够诱导PC-9细胞发生自噬。我们选取了 4 个浓度，分别是 0、2、4、8 μmol/L的Thiostrepton作用于肺癌细胞PC-9，在作用细胞48 h后，提取总蛋白，完成免疫印迹实验，结果表明(图2A所示)，随着药物浓度的增加，LC3II的表达显著升高，而p62随着浓度的升高而显著降低。通过对三次独立的实验，做会灰度比分析也表明随着Thiostrepton浓度的增加，LC3II的表达依次上升(图2B)，而p62的表达依次递减(图2C)。这结果说明Thiostrepton诱导了PC-9细胞自噬的发生。

图1 Thiostrepton抑制PC-9细胞活力Fig.1 Thiostrepton decreased cell viability in PC-9 cells

图2 Thiostrepton诱导PC-9细胞自噬Fig.2 Thiostrepton induced autophagy in PC-9 cells

2.3 抑制Thiostrepton诱导的细胞自噬减少细胞凋亡

在已有的报导中，自噬与细胞死亡关系密切，在一些情况下，自噬作用可以促进肿瘤细胞的生存和维持其活力;另外一些情况下，自噬却能促进细胞死亡。因此，在本研究中我们想知道Thiostrepton诱导的自噬是否与细胞死亡相关。接下来，我们通过用自噬抑制剂3-MA抑制Thiostrepton诱导的自噬，然后检测Thiostrepton诱导的PC-9细胞的活力的变化。通过MTT实验，我们发现在 PC-9细胞中，当Thio-strepton的浓度达到4μmol/L和8μmol/L 时，5μmol/L的3-MA能够显著增强细胞的活力(图3A和B所示)。且无论是作用24 h还是48 h，5 μmol/L的3-MA都能够部分恢复Thiostrepton抑制的细胞活力。接下来，我们通过 PI/Annexin-V实验检测了Thiostrepton的浓度在4μmol/L和 8 μmol/L 时，5μmol/L的3-MA对细胞凋亡的影响。结果如图3C和D所示，PC-9细胞在4 μmol/L的Thiostrepton作用48 h细胞的平均凋亡率为24.7%，而当4 μmol/L的Thiostrepton作用前1 h同时加 5 μmol/L的3-MA，然后两药同时作用PC-9细胞48 h，此时发现细胞的平均凋亡率为 9.2%(图 3C所示)。在8μmol/L的Thiostrepton作用48 h细胞的平均凋亡率为37%，8 μmol/L的 Thiostrepton 联合 5 μmol/L 的 3-MA 时，细胞的平均凋亡率显著减少，降低至15.2%(图3D所示)。以上结果表明，3-MA通过抑制Thiostrepton诱导的PC-9细胞凋亡。同时这也提示Thiostrepton诱导了非小细胞肺癌自噬性死亡。

图3 抑制Thiostrepton诱导的自噬减少细胞凋亡Fig.3 Inhibition of autophagy attenuated cell apoptosis induced by thiostrepton in PC-9 cells

3 讨论

目前，临床常规的化疗药物在癌症的治疗方面毒副作用很大，病人常不能耐受。因此寻找新的药物用于肿瘤的治疗是目前亟待解决的问题。新近研究发现Thiostrepton在肿瘤治疗中有潜在应用价值。本研究探讨了Thiostrepton在非小细胞肺癌中的治疗效果，发现Thiostrepton能够抑制非小细胞肺癌细胞的活力，并且诱导其凋亡。进一步研究发现Thiostrepton能够诱导非小细胞肺癌自噬。而关于Thiostrepton诱导自噬的分子机制目前尚未见报道。有报道表明，Thiostrepton能够抑制 FoxM1的表达，而FoxM1是一个癌基因，其在促进肿瘤的发生发展中起了重要作用，且FoxM1主要是作为转录因子诱导下游靶基因的表达而发挥其功能。因此有可能Thiostrepton诱导的自噬涉及到抑制FoxM1的表达而调节一些自噬基因的表达，从而诱导自噬的发生。

鉴于自噬维持细胞内环境的稳定，及其在细胞死亡中的作用。我们研究了自噬在Thiostrepton诱导细胞凋亡中的作用。通过用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后，发现Thiostrepton诱导的细胞凋亡显著减少。表明Thiostrepton可能通过诱导非小细胞肺癌细胞自噬性死亡，但其中的具体分子机制需要进一步在证据阐明。

另外，我们发现在Thiostrepton低浓度时，3-MA恢复Thiostrepton抑制细胞活力的效果并不明显。这可能的原因是低浓度Thiostrepton诱导的自噬并不明显，所以自噬起的促进细胞死亡的作用也不显著，因此此时抑制自噬不能显著增强细胞活力。并且3-MA主要通过抑制III性PI3K抑制自噬，而它同时也具有抑制I型PI3K的特性，而I型PI3K在促进细胞生长与增殖中起了重要作用，因此在Thiostrepton低浓度的诱导的低水平自噬下，3-MA可能主要是抑制了I型PI3K而抑制了细胞活力从而增强了Thiostrepton抑制细胞活力的效果。

总之我们的结果表明，硫链丝菌素促进了人非小细胞肺癌细胞的自噬性死亡，提示硫链丝菌素联合自噬诱导剂可能在临床上对治疗人非小细胞肺癌有效。

［1］KWOK J M，MYATT S S，MARSON C M，et al.Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box M1 expression［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(7):2022-2032.

［2］BHAT U G，HALASI M，GARTEL A L.Thiazole antibiotics target FoxM1 and induce apoptosis in human cancer cells［J］.PLoS One，2009，4(5):e5592.

［3］KWOK J M，MYATT S S，MARSON C M，et al.Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box M1 expression［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(7):2022-2032.

［4］CHAN D W，HUI W W，CAI P C，et al.Targeting GRB7/ERK/FOXM1 signaling pathway impairs aggressiveness of ovarian cancer cells［J］.PLoS One，2012，7(12):e52578.

［5］HALASI M，ZHAO H，DAHARI H，et al.Thiazole antibiotics against breastcancer［J］. CellCycle， 2010， 9(6):1214-1217.

［6］WANG Y，WEN L，ZHAO S H，et al.FoxM1 expression is significantly associated with cisplatin-based chemotherapy resistance and poor prognosis in advanced non-small cell lung cancer patients［J］.Lung Cancer，2013，79(2):173-179.

［7］WANG M，HALASI M，KABIROV K，et al.Combination treatment with bortezomib and thiostrepton is effective against tumor formation in mouse models of DEN/PB-induced liver carcinogenesis［J］.Cell Cycle，2012，11(18):3370-3372.

［8］KWOK J M，PECK B，MONTEIRO L J，et al.FOXM1 confers acquired cisplatin resistance in breast cancer cells［J］.Mol Cancer Res，2010，8(1):24-34.

［9］WANG M，GARTEL A L.Combination with bortezomib enhances the antitumor effects of nanoparticle-encapsulated thiostrepton［J］.Cancer Biol Ther，2012，13(3):184-189.

［10］QIAO S，LAMORE S D，CABELLO C M，et al.Thiostrepton is an inducer of oxidative and proteotoxic stress that impairs viability of human melanoma cells but not primary melanocytes［J］.Biochem Pharmacol，2012，83(9):1229-1240.

［11］UDDIN S，HUSSAIN A R，AHMED M，et al.Overexpression of FoxM1 offers a promising therapeutic target in diffuse large B-cell lymphoma［J］.Haematologica，2012，97(7):1092-1100.

［12］NEWICK K，CUNNIFF B，PRESTON K，et al.Peroxiredoxin 3 is a redox-dependent target of thiostrepton in malignant mesothelioma cells［J］.PLoS One，2012，7(6):e39404.

［13］MUKHOPADHYAY S，PANDA P K，SINHA N，et al.Autophagy and apoptosis:where do they meet?［J］.Apoptosis，2014，19(4):555-566.