四君子汤联合缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤大鼠炎症因子及氧化应激的影响

华 晨 傅天啸 傅永清 周 剑 兰 菲 任大为

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

四君子汤联合缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤大鼠炎症因子及氧化应激的影响

华 晨 傅天啸 傅永清 周 剑 兰 菲 任大为

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

目的观察四君子汤联合缺血预处理（IPC）对肝脏缺血再灌注损伤大鼠炎症因子及氧化应激的影响。方法80只SD大鼠随机分成空白对照组、四君子汤预处理组、IPC组和四君子汤预处理+IPC组，每组20只。肝脏缺血再灌注术后检测白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）；血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）；血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6），以及肝组织中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。结果四君子汤预处理+IPC组WBC、ALT及AST水平显著低于其余三组（P＜0.05）。四君子汤预处理组与IPC组的ALT、AST水平较空白对照组显著降低（P＜0.05）。四君子汤预处理+IPC组TNF-α水平显著低于其余三组（P＜0.05）。三个实验组IL-6、MDA水平显著低于空白对照组（P＜0.05），SOD水平显著高于空白对照组（P＜0.05）。各实验组间比较，四君子汤预处理+IPC组SOD水平高于其余两组（P＜0.05）。结论四君子汤联合IPC可减轻大鼠肝脏缺血再灌注过氧化损伤，抑制炎症因子，保护肝功能。

大鼠；肝脏缺血再灌注损伤；四君子汤；缺血预处理；肿瘤坏死因子α；白介素6；丙二醛；超氧化物歧化酶

肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是导致肝胆外科患者术后肝功能衰竭甚至死亡的主要原因，当前无治疗HIRI的有效方法[1]。HIRI发生机制复杂，目前认为氧化损伤、炎症反应是其病理生理机制的重要环节。近年来，针对发病机制的各种临床预处理措施成为国内外研究的热点。中药预处理具有靶点广、副作用小等特点。本研究联合中药四君子汤及缺血预处理（ischemia preconditioning，IPC）作为干预手段，观察其在大鼠HIRI过程中保护肝功能、减轻过氧化损伤、抑制炎症反应的作用及机制。

1 实验材料

1.1动 物 健康雄性SD大鼠80只，7周龄，平均体质量（220±40）g。由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2008-0115。

1.2药 品 3%戊巴比妥钠；四君子汤药物组成：人参12g，茯苓、白术各9g，炙甘草6g（中药饮片购自浙江省中医院），水煎煮2次，合并滤液浓缩至生药含量为1g/mL，冰箱冷藏备用（实验所用剂量均以生药计）。

1.3主要仪器及试剂 动物手术器械、移液器、天平、DU800分光光度仪、组织匀浆机、恒温水浴箱、脱色摇床等均由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒、白介素6（IL-6）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 实验方法

2.1分组及造模 80只大鼠随机分为空白对照组、四君子汤预处理组、IPC组和四君子汤预处理+IPC组，每组20只。大鼠肝脏缺血再灌注模型按Nauta等方法制备。3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.13mL/ 100g），取上腹部正中切口进腹，显露第一肝门部，用无损伤血管夹将门静脉和肝动脉分支夹闭，阻断入肝血流45min后，取下血管夹恢复肝脏供血。

2.2干预方法 空白对照组：缺血再灌注造模前予生理盐水灌胃5天，1次2mL，1天1次；四君子汤预处理组：缺血再灌注造模前予四君子汤灌胃5天，1次2mL，1天1次；IPC组：缺血再灌注前予缺血预处理，方法为在持续阻断肝血流前用无损伤血管钳夹闭肝脏左、中叶肝蒂10min，松开血管钳，使肝脏再灌注10min；四君子汤预处理+IPC组：缺血再灌注造模前予四君子汤灌胃，缺血预处理，方法同上。各组术后予常规补液治疗。

持续性缺血再灌注术后24h采集标本。3%戊巴比妥钠溶液麻醉（0.13mL/100g），5mL注射用针筒自大鼠心脏取血，剪取肝脏组织约10g左右，待检。

2.3检测指标 ①白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）：取全血，采用血细胞计数仪检测。②ALT、AST检测：血液样本3000r/min离心10min分离取血清，用全自动生化分析仪检测AST、ALT水平。③血清TNF-α和IL-6含量测定：采用ELISA法测定，具体步骤按试剂盒进行。④肝组织中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定：采用硫代巴比妥酸法测定各组肝组织中的MDA，羟胺法检测SOD，按试剂盒说明进行。肝脏组织加9倍量的匀浆液，用匀浆机匀浆（操作在冰水浴中进行），制成10%匀浆液，3000r/min离心10min，取上清液。MDA含量测定：MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，测吸光度值。SOD测定：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，测其吸光度。

2.4统计学方法 所有计量资料用均数±标准差（） 表示，采用方差分析。使用SPSS20.0软件包分析数据，以P＜0.05差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠血清WBC、PLT水平比较 四君子汤预处理+IPC组WBC水平显著低于空白对照组、四君子汤预处理组和IPC组（P均＜0.05）。除四君子汤预处理+IPC组外，其余三组WBC比较差异无统计学意义（P＞0.05）。四组PLT水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清WBC、PLT水平比较（） ×109/L

表1 各组大鼠血清WBC、PLT水平比较（） ×109/L

注：与四君子汤预处理+IPC组比较，*P＜0.05

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3.2各组大鼠血清ALT、AST水平比较 四君子汤预处理+IPC组ALT及AST水平较其余三组明显降低（P＜0.05）。其余三组间比较，四君子汤预处理组与IPC组的ALT及AST水平较空白对照组明显降低（P＜0.05）；四君子汤预处理组与IPC组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3.3各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 四君子汤预处理+IPC组TNF-α水平显著低于其余三组（P均＜0.05）；空白对照组与四君子汤预处理组、IPC组间TNF-α水平差异无统计学意义（P＞0.05）。三个实验组IL-6水平显著低于空白对照组（P＜0.05）；而三个实验组间IL-6差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较（） IU/L

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较（） IU/L

注：与空白对照组比较，△P＜0.05；与四君子汤预处理+IPC组比较，*P＜0.05

组别空白对照组四君子汤预处理组IPC组四君子汤预处理+IPC组n/只20 20 20 20 ALT 230.56±97.91 168.21±59.33△* 136.61±41.19△* 89.24±63.67△AST 480.26±89.65 331.11±95.62△* 301.06±101.37△* 169.32±87.44△

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（） pg/mL

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（） pg/mL

注：与空白对照组比较，△P＜0.05；与四君子汤预处理+IPC组比较，*P＜0.05

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3.4各组大鼠肝组织MDA、SOD水平比较 三个实验组MDA水平显著低于空白对照组（P＜0.05），SOD水平显著高于空白对照组（P＜0.05）。三个实验组间MDA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与四君子汤预处理组、IPC组比较，四君子汤预处理+IPC组SOD水平显著升高（P＜0.05）；而四君子汤预处理组与IPC组间SOD水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 各组大鼠肝组织MDA、SOD水平比较（）

表4 各组大鼠肝组织MDA、SOD水平比较（）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05；与四君子汤预处理+IPC组比较，*P＜0.05

组别空白对照组四君子汤预处理组IPC组四君子汤预处理+IPC组n/只20 20 20 20 MDA/（nmol/mgprot）0.91±0.51 0.67±0.22△0.72±0.17△0.59±0.25△SOD/（U/mgprot）31.23±12.32 60.51±19.72△* 49.12±14.38△* 81.54±35.19△

4 讨论

预处理是目前改善HIRI患者临床预后最有希望的措施[2]。所谓预处理是指在真正应激发生前将细胞、组织、器官暴露于非致死性应激中，以期获得抵御真正应激的能力。IPC与药物预处理是最常用的两种预处理措施。IPC是指预先使组织或器官经历短时间的缺血，以增强其对随后较长时间缺血的耐受力。药物预处理是指在长时间缺血前先使用如化疗药物及他汀类药物，以激发机体的内源性保护机制。IPC简单易行，但是有损伤血管、致血栓形成的缺点；用于预处理的药物同样具有相应副作用。中药较西药具有作用范围广，靶点多，副作用小的特点，有研究者运用丹参、参附注射液、银杏叶提取物、三七总皂苷等进行动物实验，并证实其对HIRI有保护作用[3]。四君子汤由人参、白术、茯苓、炙甘草组成，具有健脾益气功效，为治疗脾气虚证经典方剂。方中人参补益中气，健脾和胃为君；白术温脾燥湿为臣；佐以茯苓甘淡渗湿健脾，使以甘草养胃和中。全方共奏健脾和胃，益气养血之功效。研究证明四君子汤具有减轻氧化应激的作用[4]。

无论以何种方式引起的肝细胞损伤，其损伤程度可以直接由肝酶反映，因此再灌注损伤后肝酶水平是预处理方式对肝功能保护作用的重要评价指标。本研究中四君子汤预处理组或IPC组血清ALT、AST水平均较无处理空白对照组明显降低，若四君子汤预处理+IPC联合运用，则较单独运用降酶效果更加显著。

HIRI过程中，炎症因子在肝内以自分泌、旁分泌以及体液途径等方式发挥着激发和维持炎症反应的生物学效应，从而调控着再灌注损伤。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等细胞因子既可通过单个形式也可通过彼此间协同作用引起肝细胞损伤[5]。本研究发现四君子汤预处理+IPC可以降低再灌注后血WBC（P＜0.05），单独运用四君子汤预处理或IPC则无此效果，可能是两者联合运用而起到协同作用。三种预处理方法对PLT均无明显影响，推测可能是PLT变化的时间及程度与WBC不同。四君子汤预处理+IPC可以显著抑制HIRI后TNF-α和IL-6的释放（P＜0.05）；单独运用四君子汤预处理或IPC也可明显抑制IL-6水平，但对TNF-α水平无影响。可见在炎症反应及细胞因子的调控上，四君子汤预处理+IPC联合运用较单独运用对减轻炎症反应具有更可靠的作用。

HIRI是一种氧化应激反应，氧自由基在HIRI时发挥重要作用，大量氧自由基的产生是导致HIRI的主要直接原因[6]。HIRI过程中，肝细胞缺血缺氧，ATP分解产物次黄嘌呤在缺血的肝组织内大量积存，同时缺氧也使内源性抗氧化酶系统如超氧化物歧化酶（SOD）失活或耗尽；缺血还可促进胞内黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，后者在催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤的同时可利用胞内分子氧产生大量的氧自由基。组织细胞过氧化损伤后产生大量脂质过氧化物，MDA是这些脂质过氧化物最终裂解生成的主要终末产物之一，故MDA水平与过氧化损伤程度呈正相关。SOD是一种金属酶类，主要作用为催化超氧离子的歧化过程，清除氧自由基，在肝脏的缺血再灌注损伤中，对细胞起保护作用[7-8]。本研究发现四君子汤预处理+IPC联合使用可显著降低MDA，提高SOD水平，两者联合较单独使用四君子汤预处理或IPC能更显著地提高SOD水平，而MDA水平则无明显变化。显示两者联合使用能更有效地提高机体清除氧自由基的能力。

本研究结果显示，IPC和中药四君子汤通过减少炎症因子释放、抗过氧化损伤对HIRI起保护作用，两者联合运用效果更佳。然而氧化应激和炎症反应是由复杂的、多通路的细胞因子网络构成。两者之间相互影响，其中仍有很多未知的机制，需要进一步实验研究来发现和证实。四君子汤预处理联合IPC作为新的预处理手段，需要更多前瞻性临床试验支持。

［1］孔瑞，孙备，潘尚哈,等.缺血预处理联合丹酚酸B对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中华肝胆外科杂志，2010，16（12）：951-953.

［2］麻勇，姜洪池.肝脏缺血再灌注损伤的实验研究现状与展望［J］.中华实验外科杂志，2012，29（10）：1880-1882.

［3］金铃，方剑乔.中药预处理对肝缺血再灌注损伤防护作用的研究进展［J］.甘肃中医学院学报，2010，27（1）：63-65.

［4］傅永清，华晨，陈炳荣,等.四君子汤联合快速康复外科干预肝脏缺血再灌注损伤的实验研究［J］.北京中医药大学学报，2012，35（11）：757-760，795.

［5］康凯，姜洪池，赵鸣雁，等.胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢系统在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用［J］.中华外科杂志，2010，48（12）：924-928.

［6］林杰，曾仲.缺血后处理对肝脏缺血再灌注的保护机制研究进展［J］.世界华人消化杂志，2010，18（17）：1799-1803.

［7］陈亮，颜王鑫，唐兰兰，等.L-精氨酸对兔缺血再灌注损伤肝脏能量代谢的影响［J］.肝胆胰外科杂志，2010，22（3）：200-202.

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Effect of Sijunzi Decoction Combined with Ischemia Preconditioning on Inflammatory Mediators and Oxidative Stress in Rats with Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury

HUA Chen,FU Tianxiao,FU Yongqing,ZHOU Jian,et al. Department of Surgery,First Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Medical University,Hangzhou (310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Sijunzi decoction and ischemia preconditioning（IPC）on inflammatory mediators and oxidative stress in rats with hepatic ischemia-reperfusion.MethodsEighty SD rats were randomly divided into SHAM,Sijunzi decoction,IPC,and Sijunzi decoction+IPC groups（n=20 in each group）.After hepatic ischemia-reperfusion,the levels of white blood cell count（WBC）,platelet,alanine aminotransferase（ALT）, aspartate aminotransferase（AST）,tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）,interleukin-6（IL-6）,and malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）were measured.ResultsThe levels of WBC,ALT and AST in Sijunzi decoction+IPC group was significantly lower than those in other 3 groups（P＜0.05）.The levels of ALT and AST in Sijunzi decoction and IPC groups were significantly lower than those in sham group（P＜0.05）.The level of TNF-αin Sijunzi decoction+IPC group was significantly lower than that in other 3 groups（P＜0.05）.Compared with other 3 groups,the levels of IL-6 and MDA in sham group was significantly higher and SOD was significantly lower（Ps＜0.05）.The level of SOD in Sijunzi decoction+IPC group was significantly higher than that in Sijunzi decoction group and IPC group（P＜0.05）.ConclusionSijunzi decoction combined with IPC can reduce hepatic ischemiareperfusion injury in rats by alleviating inflammatory reaction,improving antioxidation capacity.

hepatic ischemia reperfusion injury；Sijunzi decoction；ischemia preconditioning；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-6；malondialdehyde；superoxide dismutase

2013-12-24

浙江省教育厅科研项目（No.Y201120554）

华晨，Tel：13858142323；E-mail：worson78@163.com