香荚兰豆的TLC鉴别及香兰素、对羟基苯甲醛的含量测定

李肖爽，卢金清，戴艺，梁欢，李雨玲，黎强

（湖北中医药大学湖北省药用植物研发中心，湖北武汉430065）

香荚兰豆的TLC鉴别及香兰素、对羟基苯甲醛的含量测定

李肖爽，卢金清*，戴艺，梁欢，李雨玲，黎强

（湖北中医药大学湖北省药用植物研发中心，湖北武汉430065）

采用薄层色谱法（TLC）对香荚兰豆原料进行了定性鉴别，并用高效液相色谱法（HPLC）同时测定香荚兰豆药材中香兰素和对羟基苯甲醛的含量。TLC法：采用正丁醇-无水乙醇-浓氨水（7∶2∶1）为展开剂，置紫外灯（254 nm）下检视。HPLC法：采用Agilent ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；以甲醇-水为流动相梯度洗脱；体积流量1.0mg/mL；检测波长分别为275 nm；柱温25℃。TLC中斑点清晰可见。香兰素线性范围为0.408μg~0.816μg（r=0.999 8），平均回收率为100.13%，RSD为1.75%；对羟基苯甲醛线性范围为0.004μg~0.020μg（r=0.9999），平均回收率为99.56%，RSD为1.20%。所测香荚兰豆中，香兰素和对羟基苯甲醛的平均含量分别为7.26%、0.37%。以上方法可靠、准确、重复性好，适用于马达加斯加香荚兰豆的鉴别及其香兰素及对羟基苯甲酸及含量测定。

香荚兰豆；薄层色谱法；高效液相色谱法；香兰素；对羟基苯甲醛

香荚兰豆为兰科香荚兰属植物香荚兰Vanilla planifoli Andrews的成熟果实，具有息风止痉、镇静抗惊等功效。绿色的香荚兰鲜豆荚经发酵生香等工艺后，形成和谐、优雅的特有芳香气味[1]。香荚兰豆主要有效成分为醛类，其中香兰素及对羟基苯甲醛作为其活性成分，是医药、香料工业等众多领域的重要中间体，香荚兰豆及制成品正适应了人们的需求，因为它不仅含有多种香气成分，而且它还富含人体所需的氨基酸[2]。杨鹿佳[3]等将一定浓度的香荚兰豆酊剂添加到各种卷烟中，并进行了加香评吸验证。目前香兰素在国内食品工业中的消费占香兰素总消费的55%，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料。

已有文献报道，采用同时蒸馏法对云南香荚兰挥发性成分进行研究，在鉴定出的化合物中含有醛类，酯类，酚类，醇类等[4]；采用反相高效液相色谱法测定云南西双版纳香荚兰商品中香荚兰醛等化合物的含量[5]，但国内外均无有关马达加斯加原产地香荚兰豆化学成分的研究报道。故本文采用TLC法对香荚兰豆原料进行了定性鉴别，并用HPLC法选择合适的色谱条件对马达加斯加原产地香荚兰豆的特征性成分香兰素、对羟基苯甲醛等进行了系统的含量测定研究，以期为今后香荚兰豆原料的质量控制提供科学的依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

DIONEX-ULTIMATE 3000高效液相色谱仪，Agilent ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；UP5200H超声波清洗器：熊猫集团南京电子计量有限公司；SartoriusCP225D电子分析天平：d=0.01mg，北京赛多利斯天平有限公司。

1.2 试剂

香荚兰豆：马达加斯加阿诺那香荚兰公司，经湖北中医药大学生药学教研室鉴定为兰科香荚兰属植物香荚兰Vanilla planifolia Andrews的成熟果实；对羟基苯甲醛对照品：中国食品药品检定研究院提供，批号为100719-200806；香兰素对照品：中国食品药品检定研究院提供，批号为100491-200901；对羟基苯甲酸对照品：中国食品药品检定研究院提供，批号为100278-201103；香草酸对照品：中国食品药品检定研究院提供，批号为110776-200402；甲醇为色谱纯：美国天地公司；其他所用试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

2 薄层鉴别

2.1 香兰素的薄层鉴别

取本品1 g，剪碎，加乙醚20mL，置锥形瓶中密塞，超声处理20min，过滤，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯定容至5mL，作为供试品溶液，按此法制得3批样品，批号分别为120415、120417、120426。另取香兰素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照中国药典2010版薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取3批供试品溶液各4μL，对照品溶液3μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-无水乙醇-浓氨水（7∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，如图1。

图1 香荚兰豆中香兰素的薄层色谱图Fig.1 Vanillae Fructus VanillinTLC

2.2 对羟基苯甲醛的薄层鉴别

取本品1 g，剪碎，加乙醚20mL，置锥形瓶中密塞，超声处理20min，过滤，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯定容至2mL，作为供试品溶液，按此法制得3批样品，批号分别为120503、120504、120509。另取对羟基苯甲醛对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照中国药典2010版薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取3批供试品溶液各15μL，对照品溶液3μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-无水乙醇-浓氨水（7∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，如图2。

图2 香荚兰豆中对羟基苯甲醛薄层色谱图Fig.2 Vanillae FructusHygroxybenzaldehyde TLC

3 含量测定方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱AgilentZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水为流动相梯度洗脱；流速为0.8mL/min；柱温为30℃；检测波长为275 nm；进样量10μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradientelution procedure

3.2 对照品溶液的制备

取香兰素对照品适量，精密称定，加75%乙醇溶液制成每1mL含香兰素50μg的溶液，即得香兰素对照品溶液。

取对羟基苯甲醛对照品适量，精密称定，加75%乙醇溶液制成每1mL含对羟基苯甲醛2μg的溶液，即得对羟基苯甲醛对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

取香荚兰豆原料约1 g，剪碎，精密称定，精密加入8倍量的75%乙醇溶液，闭塞，称定重量，超声提取，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液0.25mL至100mL量瓶中，加75%乙醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）过滤，即得供试品溶液。

3.4 系统适用性试验

取上述对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂，按照3.1中色谱条件各进样10μL，得色谱图（见图3）。

图3 香荚兰豆（A）、对羟基苯甲醛对照品（B）、香兰素对照品（C）、空白溶液（D）Fig.3 TheHPLC chromatogram of vanillae fructus（A），hygroxybenzaldehyde reference substance（B），vanillin referencesubstance（C），blank solution（D）

从图中可以看出在该条件下，香兰素、对羟基苯甲醛与相邻的峰基线分离度大于1.5，分离度良好，且样品中其它组分无干扰。

3.5 方法学考察

3.5.1 线性关系考察

精密吸取3.2中香兰素对照品溶液8.00、10.00、12.00、14.00、16.00μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样，测定峰面积。以香兰素对照品的进样量（μg）为横坐标，以其峰面积为纵坐标（mAU*min），绘制标准曲线，并计算线性回归方程：Y=34.435 0X+0.324 1，r= 0.999 8。结果表明：香兰素在0.408μg~0.816μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取3.2中对羟基苯甲醛对照品溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样，测定峰面积。以对羟基苯甲醛对照品的进样量（μg）为横坐标，以其峰面积为纵坐标（mAU*min），绘制标准曲线，并计算线性回归方程：Y= 290.982 5X-0.030 55，r=0.999 9。结果表明：对羟基苯甲醛在0.004μg~0.020μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

3.5.2 精密度试验

精密吸取2.2中对照品溶液10μL，连续进样5次，测定其峰面积，香兰素与对羟基苯甲醛峰面积的RSD分别为1.83%、0.89%，表明仪器精密度良好。

3.5.3 稳定性研究

取同一香荚兰豆供试品溶液按上述色谱条件，分别在0、4、8、12、24 h测定其峰面积，计算供试品溶液中香兰素与对羟基苯甲醛峰面积的RSD分别为1.77%和2.46%，说明样品在24 h内稳定性良好。

3.5.4 重现性试验

取同一批香荚兰豆原料样品5份，每份约1 g，精密称定，按“供试品溶液制备”方法项下操作，按上述色谱条件，分别进样10μL进行测定，并计算含量，香兰素及对羟基苯甲醛含量的RSD分别为2.15%和2.25 %，说明重现性良好。

3.5.5 加样回收试验

取0.01 g本品粉末9份，每份，精密称定，加入一定量的香兰素对照品、对羟基苯甲醛对照品，按“供试品溶液的制备”项下制备，并按上述色谱条件进行测定，计算其回收率。香兰素加样回收率为100.13%，RSD%为1.75%，对羟基苯甲醛加样回收率为99.56%，RSD%为1.20%，结果见表2。

结果表明，该方法加样回收率介于95%~105%之间，准确度良好。

表2 加样回收试验结果Tab le2 Recovery test results

3.6 样品的含量测定

取5批香荚兰豆原料，按拟定的含量测定方法，分别制备供试品溶液，每批平行测定3次。并按上述方法注入液相色谱仪，测定含量。结果马达加斯加香荚兰豆原料中香兰素的平均含量为7.26%，对羟基苯甲醛的平均含量为0.37%。

4 小结与讨论

1）制样方法的选择

由于香兰素在香荚兰豆原料中以醛类的形式存在，因此对供试品溶液的制备条件中乙醇浓度、乙醇用量、超声时间进行考察，通过正交设计实验最终确定最佳提取制备工艺为：加入8倍量75%乙醇，超声提取20min，相对提取完全，方便可靠。

2）流动相的选择

甲醇、乙腈、水（用磷酸、冰醋酸调节流动相pH）为用高效液相色谱法分析时常常采用的流动相。采用甲醇-水、甲醇-乙腈-冰醋酸、乙腈-0.02%磷酸作为流动相，在香兰素含量测定的试验中采用控制变量法，在其他色谱条件相同的情况下，观察各流动相下的色谱图，比较其图谱的分离度、出峰个数、理论塔板数等，并综合实际各项因素最终选取甲醇-水作为原料含量测定的流动相。

3）在对香荚兰豆原料中主要成分香兰素、对羟基苯甲醛进行含量测定的同时，对其他未知成分也进行了定性分析。在同一分析条件下，确定保留时间为13.86、15.03min的化合物分别为对羟基苯甲酸、香草酸。由于检测出的化合物对应的峰面积较小，含量偏低，故只对这2个化合物进行定性分析，未进行含量测定研究。

本实验建立的TLC及HPLC方法可同时测定香荚兰豆中香兰素与对羟基苯甲醛成分含量，针对两个指标成分进行分析，专属性强，简便可靠，可全面地对该药材进行质量控制，为建立香荚兰豆原药材质量标准提供了科学依据。

[1]陈德新.香荚兰豆专题系列之四—香荚兰豆初级与深度加工及其应用[J].香精香料化妆品,2006,12(6):33-37

[2]赵良.香草:餐桌新宠[J].国内外香化信息,2005(1):18

[3]杨鹿佳.天然名贵烟草增香剂香荚兰[J].烟草科学与技术,1996, (2):13

[4]任洪涛,周斌.云南香荚兰挥发性成分的研究[J].热带农业科技, 2007,30(1):25-30

[5]左国营,张青,杨翰.国产香荚兰豆有效成分的HPLC法测定[J].中国药房,1996,7(5):229-230

Identification of Vanillae Fructus by TLC and Determ ination of Vanillin and P-Hydroxybenzaldehyde

LIXiao-shuang，LU Jin-qing*，DAIYi，LIANGHuan，LIYu-ling，LIQiang

（Hubei University of Chinese Medicine/Medicinal Plant Research and Development Center of Hubei Province，Wuhan 430065，Hubei，China）

Thin-layer chromatographywas introduced asquality identification for Vanillae Fructus rawmaterial and an HPLCmethod was established for the content determination of Vanillin and P-Hydroxybenzaldehyde．TLC：Themobile phasewasbutylalcohol-absolutealcohol-ammonia liquor（7∶2∶1），theultravioletdetection was carried out at 254 nm.HPLC：The separation was performed on Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5μm）with the mobile phases of methanol-water.The flow rate was 1.0 mg/mL，the detection wavelengthswere setat275 nm and the column temperaturewasmaintained at25℃.Spots in TLCwere visible. The linear ranges of Vanillin was in a range of 0.408μg-0.816μg（r=0.999 8），the average recoverieswere 100.13%with aRSD of1.75%.The linear rangesofHydroxyben-zaldehydewasin a rangeof0.004μg-0.020μg（r=0.999 9），the average recoverieswere99.56%with a RSD of1.20%.The average contentsofVanillin and p-Hydroxyben-zaldehyde were 7.26%and 0.37%respectively．The method is simple，reliable with a good reproducibility and is applicable for the determination of Vanillin and P-Hydroxybenzaldehyde in Vanillae Fructus rawmaterial.

vanillae fructus；TLC；HPLC；vanillin；p-hydroxybenzaldehyde

2013-05-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.026

李肖爽（1990—），女（汉），硕士研究生，主要从事中药及其天然产物活性成分的研究。

*通信作者：卢金清（1955—），男（汉），教授，本科，主要从事中药及其天然产物活性成分的研究。