UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响

吕延成，潘晓瑜，黄 畅，丁 娟

(遵义医学院 珠海校区，广东 珠海 519040)

Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2, HSV-2)是人类常见疾病的病原体之一，主要引起生殖器部位或新生儿感染。HSV-2的UL54和UL29基因在病毒感染过程中起重要作用，为HSV-2病毒复制所必需。UL54基因属于HSV-2立即早期基因，编码的ICP27蛋白是一种多功能蛋白，主要调节病毒和宿主细胞mRNA的合成、成熟和运输[1]，ICP27蛋白一旦突变可影响病毒在宿主内的复制[2-3]。UL29基因编码ICP8蛋白属单链DNA结合蛋白，参与病毒复制过程中的DNA解链， ICP8蛋白表达受到抑制可影响HSV-2晚期基因的表达[4-6]。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由内源性或外源性双链RNA介导的一种转录后的基因沉默。针对目标基因设计、构建带有启动子的重组表达质粒，转录出短发夹链RNA(small hairpin RNA, shRNA)，可以特异的抑制目标基因表达。本实验通过构建pGPU6/GFP/Neo-UL54-shRNA、pGPU6/GFP/Neo-UL29-shRNA重组表达质粒，对HSV-2的UL54、UL29同时进行干扰，分析采用双基因干扰方式对HSV-2病毒复制的影响，探讨沉默UL54和UL29基因在抑制HSV-2过程中可能的协同作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料 人胚肾293细胞(HEK293)和主要试剂由校区分子生物学研究室提供，TRIzol、SYBR®PrimeScript®RT-PCR Kit购自中国大连宝生物工程有限公司， Lipofectamine2000购自Invitrogen公司， ICP27、ICP8单克隆抗体购自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 利用shRNA在线设计软件、Blast检索和RNA structure 5.0软件筛选UL54和UL29基因的干扰位点 UL54基因的干扰位点：1081-1101，序列GCGTGGTGCAAGATGTGCATT；UL29干扰位点：1461-1481，序列GCACCGGTTGGAATTGATTGC。同时设阴性对照(Negative control，NC)：序列 GTATGACAACAGCCTCAAG，序列由上海吉玛制药技术技术有限公司化学合成。使用T4 DNA连接酶将退火后的寡核苷酸双链插入到被BamH I 和Bbs I双酶切的原始载体pGPU6/GFP/Neo中。对构建的表达质粒pGPU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29进行双酶切鉴定，确定质粒构建正确。……