重视乙型肝炎病毒感染者细胞免疫的临床研究

朱晴晖

[上海市普陀区人民医院(纺一医院)中心实验室，上海 200060]

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染慢性化是世界难题，我国HBV感染者约占全球的1/3。HBV的免疫原性和感染特点、肝脏本身的主要组织相容性复合物(major histocompability complex，MHC)-Ⅰ类抗原低表达以及宿主的细胞免疫功能低下这三者构成了HBV感染的慢性化的主因，其中HBV感染者的免疫状态与其是否转为持续感染密切相关。本刊本期集中刊登与HBV感染者的细胞免疫状态分析相关的文章，专设了“乙型肝炎病毒感染者细胞免疫的临床监测”专题，希冀临床和实验室工作者的关注。

一、HBV感染者细胞免疫临床监测的必要性

感染HBV后，宿主先后启动固有免疫(naïve immunity)和适应性免疫(adaptive immunity)应答。有资料显示，成人历经明显的急性肝炎后，约1%～5%发展为慢性持续感染，其余为急性自限性感染，而免疫系统尚未成熟的婴儿和幼儿感染HBV后的慢性化率可分别高达90%和30%。这一现象提示，宿主的免疫状态，尤其是细胞免疫功能，将决定宿主识别并清除病毒(急性自限性感染)抑或导致免疫耐受(HBV的慢性持续感染)，是关乎HBV感染者预后和转归的决定性因素。

中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会的“慢性乙型肝炎防治指南”和美国国立卫生研究院将慢性HBV感染的进程分为免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低(非)复制期和再活动期等4期。处于不同时期的慢性HBV感染者不仅表现为HBV感染的血清学标志、病毒复制水平和肝损伤标志的差异，细胞免疫状态也各有特点。慢性HBV感染者细胞免疫功能的临床监测，对于明确感染者处于感染进程的哪一阶段、对临床治疗方案的选择和疗效评价都有不可替代的作用。

二、“乙型肝炎病毒感染者细胞免疫的临床监测”专题收录论文的特点

本专题中的综述“T淋巴细胞和NK细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用”重点介绍了国内外在慢性HBV感染中T淋巴细胞及其功能亚群以及自然杀伤(natural killer，NK)细胞(及其激活性和抑制性受体)的研究现状，其中NK细胞行使机体抗病毒免疫机制中的固有(天然)免疫功能，而T淋巴细胞及其功能亚群则是机体抗病毒免疫的适应性(获得性)免疫的主要执行者。文章关注这2类免疫活性细胞(受体)在慢性HBV感染中的变化特点，期待从中获得乙型肝炎诊治的新思考和新策略。

国内外文献证实，HBV感染者HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能与感染后的疾病转归关系密切，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量显著低于急性乙型肝炎和自限性乙型肝炎。“慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8+T细胞功能的初步分析”一文关注了CHB患者HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量和部分功能，与国内已发表的大多数论文仅分析CHB患者HBV包膜抗原特异性CD8+T细胞不同，该文还分析了HBV聚合酶(pol)抗原肽和HBV核心(core)抗原肽特异性CD8+T细胞，除测定CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞外，还检测了CHB患者总CD8+T细胞分泌白细胞介素(interleukin，IL)-2和 γ 干扰素(interferon-gamma，FN-γ)的功能，更为全面地了解CHB患者抗原特异性CD8+T细胞。该文从一个侧面阐述了CHB患者不能有效清除体内HBV的免疫耐受机制。

作为免疫网络的重要成员，以分泌IL-17为特征的辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)是近年颇受关注的、与炎症(及自身免疫)相关的辅助性T细胞的一个功能亚群，Th17细胞与具有免疫抑制作用的调节性T(regulatory T，Treg)细胞间的平衡在机体正常功能的维系中至关重要，而维甲酸相关孤儿核受体C(RAR-related orphan nuclear redeptor C，RORC)是Treg细胞上游调控基因，其表达水平亦与Th17功能的实现相关。“慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞比例和IL-17表达水平的临床意义”一文分析了CHB患者外周血Th17细胞比例及其效应分子IL-17的分泌能力以及纯化CD4+T细胞经抗CD3和抗CD28抗体刺激后IL-17和RORC mRNA表达水平，较全面地分析了CHB患者Th17细胞和与Treg细胞相关指标的变化;并分析上述指标与HBV DNA水平、肝损伤标志物的关系，有助于阐明Th17细胞在CHB免疫炎症损伤中的作用。该文若能按不同治疗方案分组，并做相关指标治疗前后的比较，则可分析不同治疗方案对文中涉及的指标影响，以期从中探讨可用于评价治疗效果的指标。

另一篇涉及Th17细胞和Treg细胞的论文“HBV感染者外周血Th17细胞和Treg细胞的检测及意义”分析了HBV携带者、CHB患者、肝细胞癌伴活动性肝炎等HBV感染后肝脏不同损伤程度的对象外周血Th17细胞和Treg细胞比例的变化及其与HBV感染后肝脏损伤指标的关系，揭示了外周血Th17细胞与Treg细胞比值随HBV感染后疾病的发生和发展、肝脏损伤程度依次上升，表现为趋向Th17细胞介导的炎症反应，Th17细胞与Treg细胞趋于失衡;Th17细胞比例与丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)呈显著正相关，提示Th17细胞参与了HBV感染后肝脏的炎症反应，Th17细胞可作为肝脏的炎症指标之一，是治疗HBV感染所致的肝脏炎症的潜在靶点。

各种细胞因子是免疫活性细胞实现免疫功能的效应分子，前炎性和抗炎细胞因子则参与肝脏炎症损伤过程。“HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清细胞因子水平与疾病预后的关系研究”一文分析了HBV相关慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)患者血清多种前炎性和抗炎细胞因子水平的变化，并关注其在CHB患者与HBV相关ACLF患者间、HBV相关ACLF患者死亡组与治愈组间的差异，分析上述因子与乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和HBV DNA、终末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)评分和肝功能衰竭指标之间的相关性，探讨血清中若干种细胞因子与HBV相关ACLF预后的关系。然而由于细胞因子具有多源性的特征，故血清细胞因子水平只能在一定程度上反映病患部位肝脏内免疫活性细胞分泌细胞因子的水平。

本专题的论文集中关注了涉及HBV感染者T淋巴细胞部分亚群的改变，遗憾的是，专题组织者没能约到研究HBV感染者NK细胞及其激活性和抑制性受体等的稿件，我们期待正在进行和有意愿开展HBV感染者临床细胞免疫研究的读者拓展这一领域的研究并欢迎投稿，我们将择期设置相关的专题。

三、免疫学理论的新突破为HBV感染者细胞免疫研究提供了更大的空间

近年来，基础免疫学理论研究不断取得新突破，免疫学与医学的交叉日益广泛和深入，新型免疫学技术不断涌现，有力地推动了临床免疫学的发展。作为免疫学研究的三大领域(基础免疫学研究、临床免疫学研究和免疫学技术的研发和应用)之一，临床免疫学研究重点关注免疫识别、免疫应答和免疫耐受/免疫调节等免疫学机制在相关疾病发生、发展中的作用，尤其是免疫学理论和技术在感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等重大疾病的诊断、病程观察、预后分析、治疗和预防中的应用，其中HBV感染后慢性化的免疫学机制值得关注，是临床医学和实验室工作者大有作为的领域。

机体的抗病毒功能主要依赖于细胞免疫，行使固有(天然)免疫功能的主要有NK细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)、自然杀伤T(natural killer T，NKT)细胞等。近年来NK细胞及其亚群(CD56dimCD16bright和 CD56brighCD16dim)、NK 细胞激活性受体[如 KIR 2DS5(CD158g)、NKG2C(CD159c)等]和NK细胞抑制性受体[如NKG2A(CD159a)、KIR 2DL3(CD158b2)等]在 CHB中的变化受到关注(PMID:23304062、PMID:23103614)。近年的研究证实，DC作为一种在表型和功能上呈高度异质性的细胞群体，具有激活和负调控免疫的双重功能，建议进一步关注HBV感染者的髓样DC[myeloid DC，mDC(Lin-HLADR+CD11c+CD123-)]和淋巴样DC[lymphoid DC，LDC(Lin-HLA-DR+CD11c-CD123+)]亚群的变化以及未成熟DC的标志CD1a、成熟DC的标志CD83、DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达。NKT细胞是共表达NK细胞和T细胞表面标志的特殊细胞群(CD3+CD56+CD161+TCR+)，活化后具有与NK细胞相似的细胞毒活性，有文献关注了NKT细胞及其表达的激活性受体NKG2D在介导机体对HBV感染后的免疫应答中的作用(PMID:17991774)。

参与机体抗病毒免疫的适应性(获得性)免疫和调节的细胞有巨噬细胞，T细胞及其亚群[Th1、Th2、Th17、Th22、抑制性 T(suppressor T，Ts)细胞和Treg细胞等]，B细胞及近年来证实的介导免疫耐受、抑制过度炎症反应的调节性B细胞[regulatory B cell，Breg(CD19+CD24hiCD38hi或 CD19+CD24hiCD27hi)]以及抑制免疫应答和参与肿瘤、感染、炎症、创伤和移植耐受等过程的髓源性抑制细胞[myeloid-derived suppressor cell，MDSC(代表性表型 HLA-DR-Lin1low/-CD33+CD11b+)]等，有关MDSC与慢性HBV感染的报道目前仅见于鼠类的CHB模型(PMID:21762128)，期待在人类CHB中的研究尽快付诸实施。

在慢性HBV感染的细胞免疫研究中，尤其应关注HBV持续感染者的T细胞耗竭现象，T细胞持续与高载量病毒抗原结合，逐渐发生表型缺失和功能缺陷，表达一系列抑制分子及区别于传统效应T细胞和记忆T细胞表达的细胞因子受体、转录因子及效应分子，使血循环和肝内病毒特异性CD8+细胞应答减弱和/或克隆缺失，CD4+细胞活性降低，最终导致T细胞耗竭，是病毒持续存在和感染慢性化的主要原因之一[北京302医院王福生教授在人类免疫缺陷病毒感染者中所做的观察CD4+T细胞和CD8+T细胞耗竭的工作(PMID:21592997和PMID:17272504)值得借鉴]。了解慢性HBV感染者的T细胞耗竭状况，可为免疫治疗提供可靠的依据;由于在感染得到控制、病毒得到有效清除后T细胞的耗竭现象可被逆转，因而T细胞表型和功能的恢复有希望成为评价抗病毒治疗效果的指标之一。

问世40年的流式细胞术作为现代免疫学发展最重要的技术支撑，对细胞免疫的临床研究作出了颠覆性的贡献。常用的多色流式细胞术可用于分析具有某种表型(或表型组合)和/或分泌某种细胞因子的细胞群的百分率。检测细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)推荐用流式细胞术四聚体(或五聚体)方法。由于细胞因子的多源性，外周血循环中的细胞因子水平不能完全反映个体中某一细胞群分泌细胞因子的能力，建议分离出具有特定标记的细胞群(现已有商品化的抗体标记和免疫密度离心正/负筛选法试剂，无需专供分选用的流式细胞仪)，在体外用特定的刺激物，经培养后测定上清中的细胞因子水平。分析分泌某种细胞因子的免疫活性细胞的数量还可采用酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)法等。在临床免疫学的研究中，较之对患者某些指标的单次测定，在不同的病程中的动态观察和治疗前后的追踪监测可为我们提供更有启示性的信息。有效的抗病毒治疗和免疫治疗一般都伴随有机体免疫状态的改善，除目前临床常用的评价疗效的病毒载量、生化和血清学指标外，对治疗过程细胞免疫指标的监测，将有希望发现有效的新评价指标。

飞速发展的免疫学为人类健康服务，是幻想还是现实?是免疫学理论工作者多年来的内心独白，希冀临床和实验室有识之士将这一期盼变为广大CHB患者的福音。