地塞米松通过加强自噬和抑制凋亡减轻海水吸入型肺损伤

王 莉 张敏龙 金发光

淹溺是导致意外死亡的一个重要原因，特别在15岁以下青少年意外死亡中占有很大比例[1]。急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是淹溺对机体造成的最主要的伤害之一，其中海水较淡水淹溺肺损伤更为严重，也更容易发展成为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。海水淹溺肺损伤中同时存在缺氧和高渗因素，而这两个因素常诱导自噬的产生[2-4]。

自噬(autophagy) 被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，这种形式的细胞死亡表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解[5]。自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。Beclin 1 是自噬的调控基因，是自噬的关键分子之一[6]，也可对细胞的自噬活性进行动态监测和判断。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断自噬中自噬体的形成，被广泛用作自噬的抑制剂。

凋亡(apoptosis)是Ⅰ型程序性细胞死亡，参与许多重要的生理和病理过程，与自噬共同维持内环境稳定。近年来，内皮细胞和上皮细胞凋亡在ALI发病过程中的作用日益受到重视[7-8]。本实验拟通过检测自噬与凋亡指标来判断海水淹溺型肺损伤中自噬与凋亡的关系。

材料和方法

一、 实验试剂

地塞米松和3-MA 购自 sigma 公司。地塞米松用5‰羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose)溶液制成混悬液腹腔注射，3-MA溶于PBS制成悬液腹腔注射。配方海水按照中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我国东南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相对密度1.05，渗透压1300 mmol/L。大鼠Beclin1、Bax及β-actin mRNA引物由Invitrogen Custom Primers公司合成。Beclin1抗体、Bax抗体及β-actin抗体购自Abcam公司。ECL增强化学发光剂购自美国Pierce公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

二、实验动物及分组

健康雄性SD大鼠40只，清洁级，体重220 g左右，由第四军医大学实验动物中心提供。采用完全随机方法将实验大鼠分为5组，即正常对照组、海水处理1、3、6、12 h组，每组8只。

三、细胞培养及处理

A549细胞用含有100 U/ml青链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在5% CO2培养箱中37 ℃进行培养。将上述培养的细胞分为4组，A为正常对照组，B为海水组，C为地塞米松+海水处理组，D为3-MA处理组。给B、C、D分别加入25%海水(1 ml培养液中含0.25 ml海水)，12 h后，C和D分别加入10-6M地塞米松、5×10-3M 3-MA，分别测量Beclin 1和Bax蛋白含量。

四、检测指标及方法

1.肺组织病理学检查：取各组大鼠左下肺组织迅速放入4%多聚甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片，苏木精—伊红染色法( hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光学显微镜观察。

2.肺湿干比(W/D)检测： 取每只大鼠相同肺组织，擦干表面血液及水分后电子天平称湿重，置于75 ℃烤箱内烘烤72 h至恒重后称干重，计算肺组织W/D比值。

3.Westen blot检测

(1)检测组织 Beclin 1的蛋白表达：取各组大鼠右肺下叶200 mg组织匀浆，常规裂解提取蛋白，定量煮15 min, 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转蛋白至NC膜，5%脱脂 奶粉室温封闭2 h，Beclin 1抗体(1︰1000)和β-actin抗体(1︰500)，4 ℃孵育过夜； TBST洗膜，二抗37 ℃置摇床孵育2 h，TBST洗膜，ECL发光试剂盒显影。凝胶图像分析系统检测各目标条带的灰度值，计算目的蛋白与β-actin的灰度比。

(2)检测A549细胞Beclin 1和Bax的蛋白表达：将处理过的细胞用PBS洗涤，然后常规裂解提取蛋白，定量煮15 min, 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转蛋白至NC膜，5%脱脂 奶粉室温封闭2 h，Beclin 1抗体(1︰1000)，Bax抗体(1︰1000)及β-actin抗体(1︰5 00)，4 ℃孵育过夜； TBST洗膜，二抗37 ℃置摇床孵育2 h，TBST洗膜，ECL发光试剂盒显影。凝胶图像分析系统检测各目标条带的灰度值，计算目的蛋白与β-actin的灰度比。

五、统计学方法

结 果

一、 病理学检测结果

正常对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔及支气管腔内仅见少量炎性细胞及渗出；海水组肺组织结构紊乱，肺泡间隔明显增厚，肺泡间隔及肺泡腔多见片状出血，肺泡间质和肺泡腔内有较多炎性细胞浸润。病理变化程度随海水时间增加而逐渐加重，见图1。

注：A：正常对照组；B: 海水1 h组；C：海水3 h组；D：海水6 h组；E：海水12 h组

二、 肺组织W/D检测结果

海水1 h组W/D比值显著高于正常对照组(P<0.001)，随海水注入后时间的增加而逐渐降低，见图2。

注：***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05 vs. 正常对照组

三、Western blot检测结果

1. 与正常对照组比较，海水组大鼠肺组织中Beclin1蛋白表达明显升高，随海水注入时间增加，表达量呈逐渐升高的趋势。表明海水确实可以引起大鼠肺组织Beclin 1蛋白表达上调，见图3。

2.与正常对照组相比，体外实验海水组Beclin 1表达明显升高(P<0.001﹚；与海水组相比，地塞米松组Beclin 1表达明显升高(P<0.001)，3-MA组表达降低(P<0.01﹚，表明地塞米松可以使Beclin 1表达升高，见图4。

3. 与海水组对比，地塞米松组Bax的表达下降(P<0.01)；与3-MA组相比，地塞米松组Bax表达明显下降(P<0.001)，表明地塞米松可以降低Bax蛋白表达，见图5。

注：***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05 vs. 正常对照组

注：A：正常对照组；B：12 h海水组；C：地塞米松组+12 h海水组；D：3-MA+12 h海水组；***P<0.001 vs. 正常对照组；##P<0.01 vs. 海水12 h组

注：正常对照组；B：12 h海水组；C：地塞米松组+12 h海水组；D：3-MA+12 h海水组;**P<0.01 vs. 12 h海水组；###P<0.001 vs. 3-MA+海水12 h组

讨 论

淹溺发生时溺者常因被迫吸入少量水而导致喉痉挛和低氧血症，而较长时间的低氧血症可使喉痉挛逐渐缓解，进而吸入大量的水入肺，所以炎症反应和肺水肿是吸入型肺损伤的主要病理生理变化。在本研究中，我们观察到海水吸入后，大鼠肺泡腔及肺泡间隔有片状出血以及大量炎细胞浸润，随着时间的增加，大鼠肺组织炎症浸润加重。而肺组织在海水吸入1 h时水肿最重，随后水肿程度逐渐减轻。

自噬是一种在真核细胞中普遍存在的“自我吞食”现象，在营养缺乏、缺氧、病原体感染、使用抗癌药物等应激条件下，细胞通过自身的溶酶体系统降解细胞器和/或大分子物质(长寿命蛋白质)，从而为细胞生存提供能量和营养物质，以达到维持细胞正常代谢和生存的目的[9]。研究表明在缺氧过程中，低氧可以激活BNIP3，Beclin 1和其他自噬基因表达上调。当BNIP3过度表达时，Bcl-2/Beclin 1复合体解离并释放出Beclin 1，最终ClassIUPI3K激活细胞自噬[10]。在本实验中,通过westen blot检测Beclin 1蛋白的表达，可以看出在海水吸入后，Beclin 1蛋白表达逐渐升高，表明自噬在海水吸入后被诱导。

地塞米松为急性肺损伤中常用治疗药物，可以通过减少髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在肺内的聚集来降低海水淹溺性肺损伤的肺泡出血和炎细胞浸润，以及减少血管外肺水分和肺上皮-内皮细胞屏障的通透性，上调表面蛋白-A(surface proteins-A, SPA)和Na+通道的表达，并且增加Na+/K+-ATPase的活化和Na+/K+-ATPase-α1蛋白含量[11-12]。有资料显示，地塞米松可以诱导淋巴细胞自噬，虽然机制仍然没有明确阐明，通过基因表达分析，地塞米松诱导编码应激蛋白基因的表达不同，简称为DIG2，RTP801，或 REDD1。Molitoris等[13]认为在T淋巴细胞中，糖皮质激素可以通过下调Src激酶Fyn和抑制IP3介导的钙信号来促进自噬。

凋亡是由基因控制的程序性细胞死亡，与自噬无论在形态学方面，还是生化代谢途径都有显著的差异。经研究证明，二者具有功能上的差别，其关系可以分为三类，即: ①自噬为凋亡所需，自噬通常先于凋亡，进而启动凋亡；②自噬抑制凋亡，保护细胞：自噬可保护细胞免于发生凋亡和坏死；③自噬向凋亡转化，共同促进细胞死亡[14]。本实验中，我们给海水处理过的细胞中加入地塞米松和自噬抑制剂3-MA，通过westen blot检测Beclin 1蛋白及Bcl家族的Bax蛋白发现，地塞米松组的Beclin 1蛋白表达明显高于正常对照组、海水组和3-MA组，表明地塞米松可以上调Beclin 1蛋白的表达。而地塞米松组Bax蛋白的表达则低于海水组和3-MA组，表明凋亡被抑制。可见在本实验中，地塞米松可以通过上调自噬的表达，进而抑制凋亡的发生。

参 考 文 献

1 Salomez F, Vincent JL. Drowning: a review of epidemiology, pathophysiology,treatment and prevention[J]. Resuscitation, 2004, 63(3): 261-268.

2 Hu Y L, Jahangiri A, De Lay M, et al. Hypoxia-induced tumor cell autophagy mediates resistance to anti-angiogenic therapy[J]. Autophagy, 2012, 8(6): 979-981.

3 Song Z C, Zhou W, Shu R, et al. Hypoxia induces apoptosis and autophagic cell death in human periodontal ligament cells through HIF-1alpha pathway[J]. Cell Prolif, 2012, 45(3): 239-248.

4 金发光. 急性肺损伤的诊治研究现状及进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2013， 6(1)： 1-3.

5 Klionsky D J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve[J]. Autophagy, 2008, 4(6): 740-743.

6 Yue Z, Jin S, Yang C, et al. Beclin 1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(25): 15077-15082.

7 Lu Q, Harrington E O, Rounds S. Apoptosis and lung injury[J]. Keio J Med, 2005, 54(4): 184-189.

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9 Chen N, Karantza-Wadsworth V. Role and regulation of autophagy in cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1793(9): 1516-1523.

10 Bellot G, Garcia-Medina R, Gounon P, et al. Hypoxia-induced autophagy is mediated through hypoxia-inducible factor induction of BNIP3 and BNIP3L via their BH3 domains[J]. Mol Cell Biol, 2009, 29(10): 2570-2581.

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12 金发光, 郭佑民. 地塞米松调节claudin-4减轻海水淹溺性肺水肿的机制研究[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2013， 6(2)： 124-129.

13 Molitoris JK, McColl KS, Swerdlow S, et al. Glucocorticoid elevation of dexamethasone-induced gene 2 (Dig2/RTP801/REDD1) protein mediates autophagy in lymphocytes[J]. J Biol Chem, 2011, 286(34): 30181-30189.

14 郑海燕, 王兴芬. 自噬与凋亡相互关系的分子机制探讨[J]. 医学综述, 2011, 17(1): 22-24.