环磷酰胺对肿瘤微环境调节作用的研究

问明 马振峰 张卓奇 崔乃鹏 温军业

·论著·

环磷酰胺对肿瘤微环境调节作用的研究

问明 马振峰 张卓奇 崔乃鹏 温军业

目的观察环磷酰胺(CTX)对黑色素瘤小鼠动物模型肿瘤微环境的干预及抗瘤作用。方法应用黑色素瘤细胞B16细胞株皮下接种制备荷黑色素瘤的小鼠动物模型。将不同剂量的CTX分别对不同组的小鼠模型进行腹腔注射，流式细胞术检测小鼠脾淋巴悬液中中Treg 的含量，筛选CTX最佳剂量。应用流式细胞术检测最佳剂量CTX腹腔注射后Treg水平的动态变化。应用 ELISA 法检测小鼠血清中IL-10、TGF-β水平的动态变化。定期测量肿瘤大小绘制出肿瘤的生长曲线。结果CTX腹腔注射的最佳剂量为100 mg/kg，腹腔注射CTX后Treg水平及IL-10、TGF-β水平均出现下降后再缓慢升高的波动趋势，低剂量CTX腹腔注射后不影响肿瘤的生长。结论低剂量CTX腹腔注射可以有效的调节肿瘤微环境，同时不影响荷瘤小鼠肿瘤的生长。

CTX；黑色素瘤；肿瘤微环境；Treg；IL-10；TGF-β

恶性肿瘤来源于机体正常细胞的突变，其发生与发展同宿主的机体免疫功能关系密切。机体通过免疫系统的免疫监视功能，针对突变的细胞产生一系列的免疫应答反应，从而实现对突变细胞的清除。然而在机体肿瘤发生及发展的过程中，体内肿瘤的微环境随之发生改变，进而维持肿瘤组织能够进一步生长[1,2]。存在于肿瘤微环境中的各种免疫抑制性细胞及抑制性细胞因子造就了肿瘤病变局部的免疫抑制性微环境，在肿瘤的发生发展、转移侵袭等方面发挥着重要作用。其中Treg细胞是肿瘤患者机体微环境中引起肿瘤免疫耐受的主要因素之一。同时IL-10、TGF-β1、VEGF 等细胞因子，可以扩增胸腺来源的天然 Treg并可诱导产生出更多的Treg细胞。研究显示肿瘤患者的Treg比例显著升高，与预后呈现负相关关系[3]。Treg细胞在T细胞中的比例可以反映出肿瘤微环境的变化状态。因此，对于Treg 水平进行调控成为目前肿瘤微环境干扰的研究热点。本研究通过观察低剂量CTX 对荷瘤小鼠 Treg细胞水平的影响探寻CTX应用的最佳剂量，并观察CTX对Treg水平及IL-10、TGF-β1水平的调控的动态变化情况，来评判CTX对于肿瘤微环境的干扰能力，为肿瘤免疫治疗研究提供更为详实的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与肿瘤细胞株 健康的雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证编号：SCXK 京 2009-0004)。黑色素瘤细胞B16F10细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 主要试剂及仪器 小鼠调节性 T 细胞流式检测试剂盒美国eBioscience 公司，注射用 CTX 购自江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：08012021)；RPMI1640 培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清(FCS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，转化生长因子β1(TGF-β1)Elisa kit、白介素10(IL-10)Elisa kit 美国R&D Systems公司，流式细胞仪美国Beckman Coulter公司，酶标仪美国 Thermo Electron公司

1.3 黑色素瘤荷瘤小鼠模型的建立 取对数生长期的黑色素瘤细胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，调整浓度至 1×106/ml，取瘤细胞混悬液 0.2 ml(含2×105个细胞)接种于小鼠背部皮下，观察小鼠局部注射区域出现肿瘤即成功建立黑色素瘤荷瘤小鼠模型。

1.5 环磷酰胺(CTX)腹腔注射后Treg水平及IL-10、TGF-β水平的动态变化 选取荷瘤成功小鼠，随机分为2组，A组荷瘤小鼠给予CTX腹腔注入(应用最佳剂量)(其中A1组小鼠定期处死用于Treg及血清IL-10、TGF-β水平检测，A2组小鼠用于绘制生存曲线)，B组荷瘤小鼠给予等体积生理盐水腹腔注射作为对照组(其中B1组小鼠定期处死用于Treg及血清IL-10、TGF-β水平检测，B2组小鼠用于绘制生存曲线)。分别于环磷酰胺注射前d0、注射后d1，d4，d7，d11和d15取A1及B1组相应小鼠各5只，摘眼球取外周血留取血清备ELISA检测，随后脱颈处死小鼠剖腹取出脾脏，制备脾细胞悬液流式检查Treg水平。腹腔注射CTX组及对照组小鼠均每2天使用游标卡尺测量小鼠体表瘤体的长径(a)和短径(b)，按照公式V=1/6π(ab2)计算肿瘤体积，进而绘制肿瘤生长曲线，对比CTX注射组及NS注射组肿瘤生长情况的差异。

2 结果

表1不同剂量CTX注射组荷瘤小鼠脾淋巴细胞悬液中Treg/CD4+的比例

组别Treg/CD+40mg/kg组25.78±0.9150mg/kg组15.07±1.12100mg/kg组4.56±1.05200mg/kg组10.93±1.75

2.2 环磷酰胺(CTX)腹腔注射后Treg水平及IL-10、TGF-β水平的动态变化

2.2.1 CTX腹腔注射对荷瘤小鼠Treg 细胞水平的影响：流式细胞学检测结果显示，与CTX腹腔注射前相比，CTX腹腔注射后荷瘤小鼠脾脏中Treg 细胞比例明显下降，并于注射后第4天降至最低水平。见图1。

图1 CTX腹腔注射后Treg水平的动态变化

2.2.2 CTX腹腔注射对荷瘤小鼠血清 IL-10 水平的影响：经ELISA 检测，结果显示，小鼠血清 IL-10 水平随荷瘤出现升高，CTX腹腔注射后，荷瘤小鼠模型血清中 IL-10水平较注射前出现下降，于注射后第4天水平降至最低水平。见图2。

2.2.3 CTX腹腔注射对荷瘤小鼠血清TGF-β 水平的影响：经ELISA 检测，结果显示，小鼠血清TGF-β 水平随荷瘤出现升高，CTX腹腔注射后，荷瘤小鼠模型血清中TGF-β水平较注射前出现下降，于注射后第7天水平降至最低水平。见图3。

2.3 CTX腹腔注射对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 给予CTX腹腔注射后检测肿瘤生长情况，绘制肿瘤体积变化曲线，与对照组比较，肿瘤体积变化无明显差异。见图4。

3 讨论

图2 CTX腹腔注射后IL-10水平的动态变化

图3 CTX腹腔注射后TGF-β水平的动态变化

图4 CTX腹腔注射后对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

我们继续应用100 mg/kg CTX对荷瘤小鼠进行腹腔注射，进一步试验发现经过注射后小鼠脾脏中Treg 细胞比例及血清中IL-10、TGF-β水平下降，且对于肿瘤微环境中免疫抑制因素的下调作用可以持续一定时间，有利于增强移植物的抗肿瘤效应(graft-versus-tumor effect)的发挥，同时与对照组对比发现，依照100 mg/kg给予CTX腹腔注射对于荷瘤小鼠肿瘤生长未见明显影响，提示100 mg/kg的CTX干扰微环境作为过继性回输的预处理，在改善肿瘤局部微环境的同时并不会对效应细胞疗效的评价产生影响。

总之，本研究提示低剂量CTX腹腔注射可以有效的调节肿瘤微环境，同时不影响荷瘤小鼠肿瘤的生长，为肿瘤免疫治疗相关研究中CTX在肿瘤微环境调节中的应用提供了更为详实的实验依据。

1 Dougherty GJ,Dougherty ST.Exploiting the tumor microenvironment in the development of targeted cancer gene therapy.Cancer Gene therapy,2009,16:279-290.

2 Pang YL,Zhang HG,Peng JR et al.The immunosuppressive tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma.Cancer Immunol Immunother,2009,58:877-886.

3 Curiel TJ.Tregs and rethinking cancer immunotherapy.J Clin Invest,2007,117:1167-1174.

4 Lutsiak MEC,Semnani RT,De Pascalis R,et al.Inhibition of CD4+CD25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cyclophosphamide.Blood,2005,105:2862-2868.

5 Lord EM,Penney DP,Sutherland RM,et al.Morphological and functional characteristics of cells infiltrating and destroying tumor multicellular spheroids in vivo.Virchows Archiv,1979,31:103-116.

6 Naumov GN,Folkman J,Straume O.Tumor dormancy due to failure of angiogenesis:role of the microenvironment.Clinical & experimental metastasis,2009,26:51-60.

7 Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol,1995,155:1151-1164.

8 Schabowsky RH,Madireddi S,Sharma R,et al.Targeting CD4+CD25 +FoxP3 + regulatory T-cells for the augmentation of cancer immunotherapy.Curr Opin Investig Drugs,2007,8:1002-1008.

9 Burocchi A,Pittoni P,Gorzanelli A,et al.Intratumor OX40 stimulation inhibits IRF1 expression and IL-10 production by Treg cells while enhancing CD40L expression by effector memory T cells.European journal of immunology,2011,41:3615-3626.

10 D’Alise AM,Ergun A,Hill JA,et al.A cluster of coregulated genes determines TGF-beta-induced regulatory T-cell (Treg) dysfunction in NOD mice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010,108:8737-8742.

11 Lundqvist A,Mc Coy JP,Samsel L,et al.Reduction of GVHD and enhanced antitumor effects after adoptive infusion of alloreactive Ly49-mismatched NK cells from MHC-matched donors.Blood,2007,109:3603-3606.

12 Hatiboglu MA,Kong LY,Wei J,et al.The tumor microenvironment expression of p-STAT3 influences the efficacy of cyclophosphamide with WP1066 in murine melanoma models.International Journal of Cancer,2012,131:8-17.

13 Motoyoshi Y,Kaminoda K,Saitoh O,et al.Different mechanisms for anti-tumor effects of low-and high-dose cyclophosphamide.Oncol Rep,2006,16:141-146.

14 Matsushita N,Pilon-Thomas SA,Martin LM,et al.Comparativemethodologies of regulatory T cell depletion in a murine melanoma model.J Immunol Methods,2008,333:167-179.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.13.007

071000 河北省保定市，河北大学附属医院肿瘤科(问明、马振峰、张卓奇、崔乃鹏);河北省人民医院外科(温军业)

R 979.1

A

1002-7386(2014)13-1942-04

2014-02-20)