皖南地区常见松针抑菌效果研究

曹 侃,张 爽，翁泽斌，颜翠萍，李伟东

(1.芜湖职业技术学院 生物工程学院，安徽 芜湖 241000；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

皖南地区常见松针抑菌效果研究

曹 侃1,张 爽1，翁泽斌2，颜翠萍2，李伟东2

(1.芜湖职业技术学院 生物工程学院，安徽 芜湖 241000；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

为研究松针提取物抑菌效果，采用马尾松和雪松松针的水、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸提物，分别对白色念珠菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌实验。结果表明，松针抑菌作用由强到弱的部位为正丁醇部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位，总体上雪松的抑菌作用要强于马尾松，松针提取物的体外抑菌作用跟松针的品种、部位以及供试菌种的种类有关。该研究可为今后松针抑菌作用的开发利用提供方向。

松针；提取物；抑菌效果

现代研究发现很多植物都具有较强的抑菌作用，可以此作为天然防腐剂、抑菌剂来进行开发利用。皖南地区的松针资源非常丰富，尤以马尾松、雪松最为常见。关于松针抑菌研究的报道并不多见，而且主要集中在研究松针对腐败菌的抑制作用上[1-2]，如曾维才[3]等在研究中发现，松针的水提和醇提物对常见食品腐败菌有明显的抑制作用。对于大多数的腐败菌来说，松针水提物的抑菌效果比醇提物明显。徐丽珊[4]等在松针提取物的抑菌作用实验中发现，湿地松提取液对枯草杆菌、曲霉的抑菌效果显著。这些前期的研究都没有针对雪松松针的研究，而且抑菌的菌种类型比较单一，采用的浸提方式也较少，不足以全面的分析出马尾松和雪松松针的抑菌效果。因此，本实验对以上方面进行改进，对本地区采集的马尾松、雪松的松针样本进行了抑菌实验研究，希望能为本地区松针资源的进一步开发利用打下基础。

1 材料与方法

本实验将皖南地区采集的马尾松和雪松松针作为样品，分别制备其水提、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇浸提物，以中药银黄颗粒、西药林可霉素作为对照，针对标准白色念珠菌、标准铜绿假单胞菌、临床分离的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，分别采用平皿法、试管法和牛津杯法进行体外抑菌作用的筛选实验。

1.1 松针来源

雪松松针采自安徽省芜湖市芜湖职业技术学院南校区校园内，马尾松松针采自安徽省黄山市黄山区汤口镇芳村205国道道班下三坑向阳坡处。雪松和马尾松松针药材均经过南京中医药大学陈建伟教授鉴定，为松科植物雪松属及松科植物松属的针叶。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

FA1004电子天平(上海精科天平厂)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；YXQ-2S-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X(济南鑫贝亚生物技术有限公司)。

1.2.2 试剂

乙腈(美国TEDIA试剂公司，HPLC级)；水(南京EPED制超纯水)；甲酸(南京化学试剂有限公司，分析纯)，乙酸乙酯(南京化学试剂有限公司，分析纯)，氯仿(南京化学试剂有限公司，分析纯)，正丁醇(南京化学试剂有限公司，分析纯)，其余试剂均为分析纯。

银黄颗粒(江西济民可信药业有限公司，批号：121203)；林可霉素(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂提供，批号：121005)；氯化钠(南京小营药业集团有限公司，批号：12012091301)；营养琼脂(国药集团化学试剂有限公司，批号：20111228)；营养肉汤(国药集团化学试剂有限公司，批号：20120420)。

1.3 实验菌株

标准菌株：白色念珠菌(98001)、铜绿假单胞菌(27853)，由卫生部微生物鉴定所提供。

临床分离菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，由江苏省人民医院微生物鉴定室提供。

1.4 实验方法

1.4.1 松针浸提

采集的雪松松针和马尾松松针经芜湖市中医院药剂科粉粹成1 cm的小段后干燥成初样品。取雪松和马尾松松针各200 g，分别以10倍量和8倍量的水煎煮2次，合并提取液，于90 ℃水浴浓缩至200 mL，分别以三氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各200 mL萃取3次，萃取液于90 ℃浓缩至干，以无水乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，分别获得相当于生药浓度4 g/mL的马尾松和雪松松针的氯仿浸提物、乙酸乙酯浸提物、正丁醇浸提物；然后将萃取剩余药液定容至500 mL，取100 mL加乙醇至醇浓度到50%，静置，过滤，于90 ℃浓缩至干，以50%乙醇定容于10 mL量瓶，配置成相当于生药浓度4 g/mL的马尾松和雪松的水提物；最后分别过0.45 μm微孔滤膜作为供试品溶液，于4 ℃保存备用。

1.4.2 林可霉素

在生物安全柜内取林可霉素0.67 mL(300 mg/mL)加生理盐水至10 mL，配成浓度为20 mg/mL的溶液。

1.4.3 银黄颗粒

精密称取银黄颗粒10 g加蒸馏水至10 mL，配成浓度为1 g/mL的溶液，溶解后于121 ℃消毒20 min备用。

1.4.4 抑菌实验

1.4.4.1 增菌培养

取标准白色念珠菌、铜绿假单胞菌、临床分离大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌株少许接种于肉汤培养基中，37 ℃培养18 h，取出用生理盐水稀释至10-6备用。

1.4.4.2 平皿法

采用平皿打洞法将实验菌株接种于营养肉汤中，37 ℃培养18 h，制成肉汤菌液，取出用灭菌后的生理盐水稀释至10-6备用。取肉汤琼脂培养基溶化后倒入9 cm平皿约20 mL，待其凝固。用灭菌棉签蘸取菌液均匀涂布于营养琼脂平板，然后用直径6 mm无菌钢圈均匀打洞，每平皿打4个洞，去除洞内琼脂后将供试药液加于洞中，以满而不溢为宜并作好标记，每样品做2个重复，37 ℃恒温培养20 h后取出，观察结果，测定抑菌圈直径。结果判断：抑菌圈直径小于10 mm为低度敏感或耐药；10～15 mm为中度敏感；大于15 mm为高度敏感[5]。

1.4.4.3 试管法

采用试管两倍稀释法测定样品对供试菌株的MIC。取18 h培养的各菌株营养肉汤培养物，用灭菌后的生理盐水做10-6稀释用于实验。取无菌试管8支，第1～8管各加1 mL营养肉汤；以无菌操作吸取已稀释好的药物1 mL，加入第一管。混匀后吸取1 mL加入第2管中，依次倍比稀释至第7管，混匀后自第7管弃去1 mL，此时，管中药液浓度比依次为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，第8管不加药物为对照；将肉汤培养18 h的供试菌液用无菌生理盐水稀释成10-6浓度，然后各管均加入供试菌液0.05 mL，混匀后，置于37 ℃培养箱培养16～18 h，观察结果。若肉汤混浊，表示细菌生长；若肉汤完全清亮，表示无细菌生长。

将上述MIC测定中未生长细菌的各管中的肉汤接种于营养琼脂平板上，37 ℃培养18 h后观察有无细菌生长，以细菌不生长的最高药物稀释度为该药的最低抑菌浓度(MIC)(按生药量计算)，以浊度为指标检查试管中有无细菌生长，以仍无细菌生长的管内药物的浓度为该药的最小杀菌浓度(MBC)。重复1次。

1.4.4.4 牛津杯法

牛津杯和松针提取物在121 ℃条件下高压灭菌20 min，冷却备用。将牛津杯放置于已冷却的含菌双碟平板表面，吸取150 μL的松针提取物分别注入牛津杯中，于37 ℃培养24 h，观察各平板抑菌圈直径大小。每组2个平板，每个平板放置2个牛津杯，重复2次，抑菌圈直径取平均值。

以上抑菌实验均为2个重复。

2 结果与分析

2.1 平皿法结果

雪松和马尾松松针各部位体外抑菌作用平皿法筛选实验结果如表1所示。药物样品5、6、7、8采用平皿法对标准白色念珠菌中度敏感，抑菌范围为12.5～14.25 mm；药物样品6、8对临床分离金黄色葡萄球菌中度敏感，抑菌范围为10.5～14.5 mm；药物样品8对标准铜绿假单胞菌、临床分离大肠杆菌中度敏感，抑菌范围为13～15 mm。

表1 体外抑菌作用筛选实验(平皿法n=2)

2.1.1 标准白色念珠菌结果

平皿法对标准白色念珠菌的抑菌实验结果如图1所示。

图1 平皿法标准白色念珠菌结果

图中(1)为马尾松、雪松水提物结果；(2)为马尾松、雪松氯仿部位结果；(3)为马尾松、雪松乙酸乙酯部位结果；(4)为马尾松、雪松正丁醇部位结果；(5)为林可霉素结果；(6)为银黄颗粒结果。

2.1.2 标准铜绿假单胞菌结果

平皿法对标准铜绿假单胞菌的抑菌实验结果如图2所示。

图2 平皿法标准铜绿假单胞菌结果

图中(1)为马尾松、雪松水提物结果；(2)为马尾松、雪松氯仿部位结果；(3)为马尾松、雪松乙酸乙酯部位结果；(4)为马尾松、雪松正丁醇部位结果；(5)为林可霉素结果；(6)为银黄颗粒结果。

2.1.3 大肠杆菌结果

平皿法对大肠杆菌的抑菌实验结果如图3所示。

图3 平皿法大肠杆菌结果

图中(1)为马尾松、雪松水提物结果；(2)为马尾松、雪松氯仿部位结果；(3)为马尾松、雪松乙酸乙酯部位结果；(4)为马尾松、雪松正丁醇部位结果；(5)为林可霉素结果；(6)为银黄颗粒结果。

2.1.4 金黄色葡萄球菌结果

平皿法对金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果如图4所示。

图4 平皿法金黄色葡萄球菌结果

图中(1)为马尾松、雪松水提物结果；(2)为马尾松、雪松氯仿部位结果；(3)为马尾松、雪松乙酸乙酯部位结果；(4)为马尾松、雪松正丁醇部位结果；(5)为林可霉素结果；(6)为银黄颗粒结果。

2.2 试管法结果

雪松和马尾松松针各部位体外抑菌作用试管法筛选实验结果如表2所示。药物样品1、2、5、6、7、8采用试管法对临床分离的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抑菌作用，抑菌MIC为0.125～1.25 g/mL；药物样品1、2、5、6、7、8对标准白色念珠菌、铜绿假单胞菌有抑菌作用，抑菌MIC为0.125～1 g/mL；药物样品3对标准白色念珠菌有抑菌作用，抑菌MIC为1 g/mL。

表2 体外抑菌作用筛选实验(试管法n=2)

2.3 牛津杯法结果

雪松和马尾松松针各部位体外抑菌作用牛津杯法筛选实验结果如表3所示。药物样品1、2、3、4、5、6、7、8采用牛津杯法对标准白色念珠菌、铜绿假单胞菌、临床分离金黄色葡萄球菌、大肠杆菌不敏感。

表3 体外抑菌作用筛选实验(牛津杯法n=2)

3 讨论

本研究发现，马尾松和雪松松针的不同提取物对标准白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有一定程度的抑菌作用；然而不同品种的松针、同一种松针的不同提取物，对不同供试菌的抑菌作用有明显差异。

实验结果显示，雪松松针对供试菌的抑菌作用强于马尾松，不同提取物的抑菌作用为正丁醇>乙酸乙酯>氯仿，因此未来在研发松针抑菌剂时可以考虑以雪松的正丁醇浸提物作为重点；同时在本实验研究的供试菌中，松针提取物对标准白色念珠菌的抑菌效果更为明显，因此可以重点开发松针对含有标准白色念珠菌物质的保护。

[1] 肖靖萍,任宇红.松针抑菌作用的研究[J].食品科学,1994(2):52-54.

[2] 张军民,石晓峰,范彬.雪松的化学成分及药理活性研究进展[J].中成药,2009,31(6):928-933.

[3] 曾维才,贾利蓉.松针提取物抑菌作用的研究[J].食品科学,2009,30(7):87-90.

[4] 徐丽珊,张萍华,张敏欢.松针提取物的抑菌作用初探[J].食品科学,2009,30(1):38-41.

[5] 李榆梅.微生物学[M].北京:中国医药科技出版社,2002:131-132.

2014-06-26

安徽省青年人才基金项目：裕溪口香菜中腐败菌菌相分析及保鲜技术研究(2010SQRW188)；安徽省省级专业综合改革试点：食品营养与检测专业(2013zy101)；芜湖职业技术学院自然科学研究项目：皖南地区松针抗氧化有效部位的筛选及特征图谱的研究(Wzyzr201315)

曹侃(1984-)，女，安徽芜湖人，芜湖职业技术学院讲师，硕士。研究方向：生物技术； 通讯作者：李伟东(1969-)，男，江苏南京人，南京中医药大学副研究员，博士。研究方向：中药学。

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