中药软肝宁对实验性肝纤维化大鼠TGFβ1Smad2/3表达的影响

王桂杰+李岩

【摘要】目的观察四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化后应用软肝宁的疗效及作用机制。方法用40% CCl4对Wistar大鼠造模8周, 将50只分为中药预防组、中药治疗组、模型对照组及正常对照组, 用软肝宁于造模第1周及第4周开始灌胃。运用免疫组织化学(S-P)技术检测转化生长因子β1 (TGFβ1)、Smad2/3在肝内表达, 碱水解法检测肝组织羟脯胺酸(Hyp)含量, 酶联免疫法检测肝组织内透明质酸(HA)的含量。结果经软肝宁防治后大鼠肝组织内TGFβ1、Smad2/3表达减少, 透明质酸、羟脯胺酸水平降低。结论复方中药制剂软肝宁能有效地逆转四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的纤维化, 其机理可能是抑制肝内TGFβ1、Smad2/3 表达。

【关键词】中药；肝纤维化； 羟脯胺酸；透明质酸；转化生长因子β1；Samd2/3

Effect of traditional Chinese medicine Ruan Gan Ning on the expression of TGFβ1 and Smad2/3 in the experimental rat hepatic fibrosis WANG Gui-jie. LI Yan. Shengyang Sixth People's Hopspital, Shenyang 110006, China

【Abstract】Objective To observe the therapeutic effect and mechanism of Ruan Gan Ning on the rat hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCL4). Methods 50 Wistar rats were divided into normal control , model control, TCM prevention and TCM therapy groups. At the first and forth week of model-making, the rats were given Ruan Gan Ning through intragastric administration. The expression of TGFβ1 and Smad2/3 in the liver tissue was detected with immunohistochemistry(S-P) and the content of Hyp with alkaline hydrolysis, the content of hyaluronic acid(HA) with euzymelinked immunosorbent assay. Results After the application of Ruan Gan Ning the expression of TGFβ1, Smad2/3 and the level of HA and Hyp decreased in the experimental rat hepatic fibrosis. Conclusion Ruan Gan Ning can relieve the rat hepatic fibrosis induced by CCL4 and the mechanism of action may be its inhibition of expression of TGFβ1, Smad2/3 in the liver tissue.

【Key words】Traditional Chinese medicine; Hepatic fibrosis; Hyaluronic acid; Transforming growth factor β1; Smad2/3本文针对肝纤维化“瘀血”、“症积痞块”所致病理症结, 拟以疏肝理脾、活血化瘀治疗原则的软肝宁方剂, 进行实验研究, 以期阐明该方治疗肝纤维化的作用机制。

1材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1实验动物由中国医科大学第二临床学院实验动物中心提供的雌雄各半、清洁级 Wistar大鼠50只。

1. 1. 2实验药物软肝宁内含柴胡20 g、白术12 g、桃仁12 g等, 购于辽宁中医学院药剂科, 煎好用干燥箱加工成颗粒剂备用, 用前溶解成浓度0.4 g/ml的溶液。

1. 2仪器与试剂

1. 2. 1模型制备肝纤维化大鼠模型制作参照Mont fort等方法略加改进。Wistar 大鼠, 雌雄各半, 体质量160~260 g, 按2 ml/kg体质量, 2次/周腹腔注射40 % CCl4造模8周。

1. 2. 2主要试剂羟脯胺酸(Hyp)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；透明质酸(HA)试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司；免疫组织化学TGFβ1、Smad2/3一抗及二抗试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1. 2. 3主要仪器全自动图像分析系统为C5050及图像分析软件。

1. 3方法

1. 3. 1分组及用药大鼠50只, 随机分为四组：A组为正常组(即空白对照组)(n=8), B组为肝纤维化模型组(n=12), C组为中药预防组(n=12), D组为中药治疗组(n=18)。B、C、D 组造膜, C、D 组分别于造模第1、4周开始中药软肝宁灌胃, C组、D组3 ml/kg灌胃。全部大鼠于第8 周末处死, 处死前称体质量, 剖腹取肝右叶于10%中性甲醛固定, 余肝组织-70℃冰箱保存。

1. 3. 2实验方法HA均需要肝匀浆制备：肝组织解冻后, 生理盐水反复冲洗, 滤纸吸干, 切取小块, 电子分析天平精确称重(150±5)mg, 置于干净试管内, 按11:9加入生理盐水, 高速分散器匀浆, 低温高速离心机3000 r/min , 15 min后, 取上清液, 以上操作均于冰浴中进行, 应用酶联免疫法按试剂盒说明进行检测。Hyp检测为碱水解法, 按试剂盒说明进行。免疫组化采用S -P法检测, 按照试剂盒说明书操作。

1. 3. 3免疫组化结果量化随机选取每张切片6个视野(×400倍), 采用全自动图像分析进行定量分析, 测定阳性细胞的吸光度(A值)及面积, 以两者乘积表示组织中该抗原相对含量, 乘积越大表示抗原含量越高。

1. 4统计学方法采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2. 1动物一般状况观察模型组大鼠从实验开始后1 周起每次腹腔注射后兴奋, 躁动不安。随着造模时间延长, 饮食下降, 喜卧, 毛色渐无光泽, 大便稀软不成形, 体质量明显比正常组低, 精神萎靡不振。应用软肝宁灌胃后饮食好转、体质量增加。实验过程中B组大鼠死亡4只, C组实验中死亡3只, D组实验中死亡5只, 实验结束时各组大鼠数量: 正常组8只, 模型组8 只, 中药预防组9只, 中药治疗组13只。实验终末A组平均每只体质量增加(107.00±12.20)g；B组每只体质量增加(45.75±10.01)g；显著低于A 组(P<0.01)；C组平均每只体质量增加(65.2±9.3)g, D组平均每只体质量增加(63.85±10.86)g, C、D组与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

endprint

2. 2TGFβ1、Smad2/3在肝组织中的表达与分布 阳性组织呈棕色, 阴性部分呈蓝色。①A组肝组织: Smad2/3在正常肝细胞内, 汇管区基质及间质细胞胞浆内均无表达, TGFβ1在上述部位无表达, 在Disse 间隙偶有表达。②B组肝组织: 肝内TGFβ1、Smad2/3表达明显强, TGFβ1表达极为强烈, 阳性细胞数目明显增多, 主要见于小叶周围扩大的纤维组织内的成纤维细胞、窦周细胞、炎性细胞以及增生的胆小管周围梭状细胞及肝细胞内, 阳性物质主要集中在胞浆内, 胞膜上也有少量表达。本组肝组织Smad2/3 表达主要集中在肝细胞胞浆内, 阳性细胞着色棕黄。③ C、D 组：TGFβ1、Smad2/3在肝组织内的表达量较B组减少, 阳性表达集中同B组, 阳性程度弱于B 组, D组表达明显强于C组。各种成分在不同实验组中表达经计算机软件分析结果, 见表1, 图1。

表1中药对大鼠肝组织中TGFβ1、Smad2/3平均光密度

表达量化结果的影响( x-±s)

组别 例数 TGFβ1 Smad2/3

正常组 8 0.51±0.20 0.21±0.11

模型组 8 5.69±0.6a 0.46±0.22a

预防组 9 2.76±0.79abc 0.24±0.10bd

治疗组 13 3.45±0.57ab 0.27±0.10ab

注：与正常组比较aP<0.01；与模型组比较bP<0.01；与治疗组比较cP<0.05；与治疗组比较dP>0.05

图1 中药对各组大鼠肝组织中TGFβ1和Smad2/3

光密度量化结果的影响

2. 3中药软肝宁对CCl4肝纤维化大鼠肝组织的Hyp、HA影响试验结束时模型组肝组织Hyp、HA数值远远高于正常组, 而中药治疗组和中药预防组Hyp、HA数值低于模型组。各组与正常组比较, 差异具有统计学意义(P<0.01), 预防组、治疗组与模型组比较, 差异具有统计学意义(P<0.01), 预防组观察指标虽明显优于治疗组, 但两者比较差异无统计学意义。具体结果见表2。

表2各组大鼠肝组织Hyp及HA比较( x-±s)

组别 例数 Hyp(μg/g) HA(ng/g)

正常组 8 103.33±41.63 55.68±21.74

模型组 8 380.12±24.97b 243.31±57.81b

治疗组 13 231.33±52.60ab 133.29±31.69ab

预防组 9 204.00±17.34abc 127.39±24.52abc

注：与正常组比较bP<0.01, 与模型组比较aP<0.01, 与治疗组比较cP>0.05

3讨论

软肝宁方剂中柴胡为君药疏肝, 臣药炒白术补脾, 再配以丹参、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中医辨证治疗纤维化原则。方中丹参能够显著抑制成纤维细胞的增生, 使星状细胞凋亡［1］。川芎嗪能减少透明质酸和胶原产生, 并提高肝组织SOD的活性, 减少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 从而抑制肝星状细胞活化, 减缓肝纤维增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纤维化机制是能增加肝血流量, 降低肝组织胶原含量, 促进肝内纤维胶原分解代谢［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纤维化的最重要细胞因子之一［4］。在肝脏中肝星状细胞、肝细胞、枯否氏细胞、血小板等多种细胞产生此种因子, 可促进HSC活化并分泌多种胶原, 激活静止状态的HSC, 抑制细胞外基质( ECM)降解、进而抑制肝细胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信号在细胞内转导的蛋白, 是TGFβ/Smad信号通路中组成部分, 在调控TGFβ1介导的细胞外基质积聚过程中起作用, 能介导TGFβ1信号转导, 促进肝纤维化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受体激酶的底物, 两者介导类似的信号且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同时使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信号转运通路中的桥梁, 抑制它们的生成、核转位和磷酸化, 进而抑制肝纤维化, 其中Smad3与肝纤维化的关系最为密切［6, 7］。

肝星状细胞能产生HA, 其内皮细胞中降解, 肝纤维化时产生增加。肝纤维化时肝星状细胞合成HA增加, 摄取降解减少, 是判定肝纤维化活动较敏感的指标［8, 9］。肝细胞受损后释放出羟脯胺酸, 它是肝脏胶原蛋白独有的氨基酸, 测定其含量, 可确定胶原总体含量, 可推算胶原增生与肝纤维化程度［10］。

本实验随着CCl4给药时间的增长, 大鼠肝组织透明质酸和羟脯胺酸结果显示, 模型组大鼠HA、Hyp数值升高, 中药预防组和治疗组, HA、Hyp数值也有所升高, 这三组与正常组相比P<0.01, 差异有统计学意义。本实验说明随着肝纤维化表现的加重, 肝组织内反映肝纤维化指标HA、Hyp的数值也相应升高, 而应用中药可降低肝细胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝组织中TGFβ1、Smad2/3免疫组化染色显示：模型组显微镜下阳性细胞数量及分布范围明多于中药治疗组和预防组, 计算机光密度分析数据与镜下观测结论一致, 模型组与预防组和治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)。这说明中药软肝宁是通过减少活化的星状细胞分泌TGFβ1、减轻细胞的坏死和变性, 恢复肝功能, 抑制胶原沉积和生成, 抑制肝细胞内Smad2和Smad3蛋白质的表达和磷酸化, 减少TGFβ1表达, 抑制星状合成胶和原［11］。由此研究可进一步得出结论：肝组织中Smad2/3蛋白质增多, TGFβ1分泌增加导致肝星状细胞增殖, 它们之间正相关, 与相关文献报道相似［7］。

本研究表明复方中药方软肝宁能延缓肝纤维化, 其机制可能是抑制TGFβ1表达其下游信号Smad2/3, 减少肝内胶原生成和沉淀, 减轻免疫损害, 降低肝脏的纤维化, 可临床推广价值此类复方中药。

参考文献

［1］ 赵辉平, 王胜春, 胡咏武, 等.五灵胶囊对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β/Smad及Ras/ERK信号通路蛋白的影响.胃肠病学和肝病学杂志, 2009, 18(5):392-396.

［2］ 陈爽, 张艳, 李孝生.川芎嗪对大鼠肝纤维化转化生长因子阻、Smad 2/3表达的影响.胃肠病学和肝病学杂志, 2013, 22(10):971-973.

［3］ Wu XL, Zeng WZ, Jiang MD, et al. Effect of Oxymatrineon the TGFbeta-Smad signaling pathway in rats with CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol, 2008, 14(13):2100-2105.

［4］ 党双锁, 李亚萍.TGF-β1在肝纤维化研究中的新进展.世界华人消化杂志, 2010, 18(16):1631-1636.

［5］ Hamasaki K, Nakashima M , Naito S, et al. The sympathetic nervous system promotes carbon tetrachlo ride-induced liver cirrhosis in rats by supp ressing apop to sis and enhancing the grow thkinetics of regenerating hepatocytes. J Gast roenterol, 2001, 36(2):111.

［6］ 曹平, 刘立新, 郭晓红, 等. Smad3沉默对IGFBPrPl诱导肝星状细胞分泌细胞外基质作用的影响.中华肝胆外科杂志, 2011, 17(2):142-145.

［7］ Latella G, Vetuschi A, Sferra R, et al.Targeted disruption of Smad3 confers resistance to the development of dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in mice.Liver Int, 2009(29):997-1009.

［8］ 蔡卫民, 陶君, 翁红雷, 等.血清纤维化指标的影响因素分析.中华肝脏病杂志, 2003, 11 (1) :23.

［9］ Oberti F, Valsesia E, Pilette C, et al. No invasive diagnosis of hepatic fibrosis or cirrhosis.Gastroenterology, 1997, 113(5):1609-1616.

［10］骆抗先.肝纤维化的血清学诊断.临床肝胆病杂志, 1996, 12(1):1-2.

［11］Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, et al. Boswellia serrata and Salvia mihiorrhiza extracts reduce DMN-induced hepatic fibrosis in mice by TGF-betal downregulation. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(11):1484-1498.

［收稿日期：2014-03-20］

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2. 2TGFβ1、Smad2/3在肝组织中的表达与分布 阳性组织呈棕色, 阴性部分呈蓝色。①A组肝组织: Smad2/3在正常肝细胞内, 汇管区基质及间质细胞胞浆内均无表达, TGFβ1在上述部位无表达, 在Disse 间隙偶有表达。②B组肝组织: 肝内TGFβ1、Smad2/3表达明显强, TGFβ1表达极为强烈, 阳性细胞数目明显增多, 主要见于小叶周围扩大的纤维组织内的成纤维细胞、窦周细胞、炎性细胞以及增生的胆小管周围梭状细胞及肝细胞内, 阳性物质主要集中在胞浆内, 胞膜上也有少量表达。本组肝组织Smad2/3 表达主要集中在肝细胞胞浆内, 阳性细胞着色棕黄。③ C、D 组：TGFβ1、Smad2/3在肝组织内的表达量较B组减少, 阳性表达集中同B组, 阳性程度弱于B 组, D组表达明显强于C组。各种成分在不同实验组中表达经计算机软件分析结果, 见表1, 图1。

表1中药对大鼠肝组织中TGFβ1、Smad2/3平均光密度

表达量化结果的影响( x-±s)

组别 例数 TGFβ1 Smad2/3

正常组 8 0.51±0.20 0.21±0.11

模型组 8 5.69±0.6a 0.46±0.22a

预防组 9 2.76±0.79abc 0.24±0.10bd

治疗组 13 3.45±0.57ab 0.27±0.10ab

注：与正常组比较aP<0.01；与模型组比较bP<0.01；与治疗组比较cP<0.05；与治疗组比较dP>0.05

图1 中药对各组大鼠肝组织中TGFβ1和Smad2/3

光密度量化结果的影响

2. 3中药软肝宁对CCl4肝纤维化大鼠肝组织的Hyp、HA影响试验结束时模型组肝组织Hyp、HA数值远远高于正常组, 而中药治疗组和中药预防组Hyp、HA数值低于模型组。各组与正常组比较, 差异具有统计学意义(P<0.01), 预防组、治疗组与模型组比较, 差异具有统计学意义(P<0.01), 预防组观察指标虽明显优于治疗组, 但两者比较差异无统计学意义。具体结果见表2。

表2各组大鼠肝组织Hyp及HA比较( x-±s)

组别 例数 Hyp(μg/g) HA(ng/g)

正常组 8 103.33±41.63 55.68±21.74

模型组 8 380.12±24.97b 243.31±57.81b

治疗组 13 231.33±52.60ab 133.29±31.69ab

预防组 9 204.00±17.34abc 127.39±24.52abc

注：与正常组比较bP<0.01, 与模型组比较aP<0.01, 与治疗组比较cP>0.05

3讨论

软肝宁方剂中柴胡为君药疏肝, 臣药炒白术补脾, 再配以丹参、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中医辨证治疗纤维化原则。方中丹参能够显著抑制成纤维细胞的增生, 使星状细胞凋亡［1］。川芎嗪能减少透明质酸和胶原产生, 并提高肝组织SOD的活性, 减少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 从而抑制肝星状细胞活化, 减缓肝纤维增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纤维化机制是能增加肝血流量, 降低肝组织胶原含量, 促进肝内纤维胶原分解代谢［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纤维化的最重要细胞因子之一［4］。在肝脏中肝星状细胞、肝细胞、枯否氏细胞、血小板等多种细胞产生此种因子, 可促进HSC活化并分泌多种胶原, 激活静止状态的HSC, 抑制细胞外基质( ECM)降解、进而抑制肝细胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信号在细胞内转导的蛋白, 是TGFβ/Smad信号通路中组成部分, 在调控TGFβ1介导的细胞外基质积聚过程中起作用, 能介导TGFβ1信号转导, 促进肝纤维化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受体激酶的底物, 两者介导类似的信号且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同时使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信号转运通路中的桥梁, 抑制它们的生成、核转位和磷酸化, 进而抑制肝纤维化, 其中Smad3与肝纤维化的关系最为密切［6, 7］。

肝星状细胞能产生HA, 其内皮细胞中降解, 肝纤维化时产生增加。肝纤维化时肝星状细胞合成HA增加, 摄取降解减少, 是判定肝纤维化活动较敏感的指标［8, 9］。肝细胞受损后释放出羟脯胺酸, 它是肝脏胶原蛋白独有的氨基酸, 测定其含量, 可确定胶原总体含量, 可推算胶原增生与肝纤维化程度［10］。

本实验随着CCl4给药时间的增长, 大鼠肝组织透明质酸和羟脯胺酸结果显示, 模型组大鼠HA、Hyp数值升高, 中药预防组和治疗组, HA、Hyp数值也有所升高, 这三组与正常组相比P<0.01, 差异有统计学意义。本实验说明随着肝纤维化表现的加重, 肝组织内反映肝纤维化指标HA、Hyp的数值也相应升高, 而应用中药可降低肝细胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝组织中TGFβ1、Smad2/3免疫组化染色显示：模型组显微镜下阳性细胞数量及分布范围明多于中药治疗组和预防组, 计算机光密度分析数据与镜下观测结论一致, 模型组与预防组和治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)。这说明中药软肝宁是通过减少活化的星状细胞分泌TGFβ1、减轻细胞的坏死和变性, 恢复肝功能, 抑制胶原沉积和生成, 抑制肝细胞内Smad2和Smad3蛋白质的表达和磷酸化, 减少TGFβ1表达, 抑制星状合成胶和原［11］。由此研究可进一步得出结论：肝组织中Smad2/3蛋白质增多, TGFβ1分泌增加导致肝星状细胞增殖, 它们之间正相关, 与相关文献报道相似［7］。

本研究表明复方中药方软肝宁能延缓肝纤维化, 其机制可能是抑制TGFβ1表达其下游信号Smad2/3, 减少肝内胶原生成和沉淀, 减轻免疫损害, 降低肝脏的纤维化, 可临床推广价值此类复方中药。

参考文献

［1］ 赵辉平, 王胜春, 胡咏武, 等.五灵胶囊对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β/Smad及Ras/ERK信号通路蛋白的影响.胃肠病学和肝病学杂志, 2009, 18(5):392-396.

［2］ 陈爽, 张艳, 李孝生.川芎嗪对大鼠肝纤维化转化生长因子阻、Smad 2/3表达的影响.胃肠病学和肝病学杂志, 2013, 22(10):971-973.

［3］ Wu XL, Zeng WZ, Jiang MD, et al. Effect of Oxymatrineon the TGFbeta-Smad signaling pathway in rats with CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol, 2008, 14(13):2100-2105.

［4］ 党双锁, 李亚萍.TGF-β1在肝纤维化研究中的新进展.世界华人消化杂志, 2010, 18(16):1631-1636.

［5］ Hamasaki K, Nakashima M , Naito S, et al. The sympathetic nervous system promotes carbon tetrachlo ride-induced liver cirrhosis in rats by supp ressing apop to sis and enhancing the grow thkinetics of regenerating hepatocytes. J Gast roenterol, 2001, 36(2):111.

［6］ 曹平, 刘立新, 郭晓红, 等. Smad3沉默对IGFBPrPl诱导肝星状细胞分泌细胞外基质作用的影响.中华肝胆外科杂志, 2011, 17(2):142-145.

［7］ Latella G, Vetuschi A, Sferra R, et al.Targeted disruption of Smad3 confers resistance to the development of dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in mice.Liver Int, 2009(29):997-1009.

［8］ 蔡卫民, 陶君, 翁红雷, 等.血清纤维化指标的影响因素分析.中华肝脏病杂志, 2003, 11 (1) :23.

［9］ Oberti F, Valsesia E, Pilette C, et al. No invasive diagnosis of hepatic fibrosis or cirrhosis.Gastroenterology, 1997, 113(5):1609-1616.

［10］骆抗先.肝纤维化的血清学诊断.临床肝胆病杂志, 1996, 12(1):1-2.

［11］Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, et al. Boswellia serrata and Salvia mihiorrhiza extracts reduce DMN-induced hepatic fibrosis in mice by TGF-betal downregulation. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(11):1484-1498.

［收稿日期：2014-03-20］

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2. 2TGFβ1、Smad2/3在肝组织中的表达与分布 阳性组织呈棕色, 阴性部分呈蓝色。①A组肝组织: Smad2/3在正常肝细胞内, 汇管区基质及间质细胞胞浆内均无表达, TGFβ1在上述部位无表达, 在Disse 间隙偶有表达。②B组肝组织: 肝内TGFβ1、Smad2/3表达明显强, TGFβ1表达极为强烈, 阳性细胞数目明显增多, 主要见于小叶周围扩大的纤维组织内的成纤维细胞、窦周细胞、炎性细胞以及增生的胆小管周围梭状细胞及肝细胞内, 阳性物质主要集中在胞浆内, 胞膜上也有少量表达。本组肝组织Smad2/3 表达主要集中在肝细胞胞浆内, 阳性细胞着色棕黄。③ C、D 组：TGFβ1、Smad2/3在肝组织内的表达量较B组减少, 阳性表达集中同B组, 阳性程度弱于B 组, D组表达明显强于C组。各种成分在不同实验组中表达经计算机软件分析结果, 见表1, 图1。

表1中药对大鼠肝组织中TGFβ1、Smad2/3平均光密度

表达量化结果的影响( x-±s)

组别 例数 TGFβ1 Smad2/3

正常组 8 0.51±0.20 0.21±0.11

模型组 8 5.69±0.6a 0.46±0.22a

预防组 9 2.76±0.79abc 0.24±0.10bd

治疗组 13 3.45±0.57ab 0.27±0.10ab

注：与正常组比较aP<0.01；与模型组比较bP<0.01；与治疗组比较cP<0.05；与治疗组比较dP>0.05

图1 中药对各组大鼠肝组织中TGFβ1和Smad2/3

光密度量化结果的影响

2. 3中药软肝宁对CCl4肝纤维化大鼠肝组织的Hyp、HA影响试验结束时模型组肝组织Hyp、HA数值远远高于正常组, 而中药治疗组和中药预防组Hyp、HA数值低于模型组。各组与正常组比较, 差异具有统计学意义(P<0.01), 预防组、治疗组与模型组比较, 差异具有统计学意义(P<0.01), 预防组观察指标虽明显优于治疗组, 但两者比较差异无统计学意义。具体结果见表2。

表2各组大鼠肝组织Hyp及HA比较( x-±s)

组别 例数 Hyp(μg/g) HA(ng/g)

正常组 8 103.33±41.63 55.68±21.74

模型组 8 380.12±24.97b 243.31±57.81b

治疗组 13 231.33±52.60ab 133.29±31.69ab

预防组 9 204.00±17.34abc 127.39±24.52abc

注：与正常组比较bP<0.01, 与模型组比较aP<0.01, 与治疗组比较cP>0.05

3讨论

软肝宁方剂中柴胡为君药疏肝, 臣药炒白术补脾, 再配以丹参、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中医辨证治疗纤维化原则。方中丹参能够显著抑制成纤维细胞的增生, 使星状细胞凋亡［1］。川芎嗪能减少透明质酸和胶原产生, 并提高肝组织SOD的活性, 减少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 从而抑制肝星状细胞活化, 减缓肝纤维增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纤维化机制是能增加肝血流量, 降低肝组织胶原含量, 促进肝内纤维胶原分解代谢［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纤维化的最重要细胞因子之一［4］。在肝脏中肝星状细胞、肝细胞、枯否氏细胞、血小板等多种细胞产生此种因子, 可促进HSC活化并分泌多种胶原, 激活静止状态的HSC, 抑制细胞外基质( ECM)降解、进而抑制肝细胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信号在细胞内转导的蛋白, 是TGFβ/Smad信号通路中组成部分, 在调控TGFβ1介导的细胞外基质积聚过程中起作用, 能介导TGFβ1信号转导, 促进肝纤维化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受体激酶的底物, 两者介导类似的信号且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同时使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信号转运通路中的桥梁, 抑制它们的生成、核转位和磷酸化, 进而抑制肝纤维化, 其中Smad3与肝纤维化的关系最为密切［6, 7］。

肝星状细胞能产生HA, 其内皮细胞中降解, 肝纤维化时产生增加。肝纤维化时肝星状细胞合成HA增加, 摄取降解减少, 是判定肝纤维化活动较敏感的指标［8, 9］。肝细胞受损后释放出羟脯胺酸, 它是肝脏胶原蛋白独有的氨基酸, 测定其含量, 可确定胶原总体含量, 可推算胶原增生与肝纤维化程度［10］。

本实验随着CCl4给药时间的增长, 大鼠肝组织透明质酸和羟脯胺酸结果显示, 模型组大鼠HA、Hyp数值升高, 中药预防组和治疗组, HA、Hyp数值也有所升高, 这三组与正常组相比P<0.01, 差异有统计学意义。本实验说明随着肝纤维化表现的加重, 肝组织内反映肝纤维化指标HA、Hyp的数值也相应升高, 而应用中药可降低肝细胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝组织中TGFβ1、Smad2/3免疫组化染色显示：模型组显微镜下阳性细胞数量及分布范围明多于中药治疗组和预防组, 计算机光密度分析数据与镜下观测结论一致, 模型组与预防组和治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)。这说明中药软肝宁是通过减少活化的星状细胞分泌TGFβ1、减轻细胞的坏死和变性, 恢复肝功能, 抑制胶原沉积和生成, 抑制肝细胞内Smad2和Smad3蛋白质的表达和磷酸化, 减少TGFβ1表达, 抑制星状合成胶和原［11］。由此研究可进一步得出结论：肝组织中Smad2/3蛋白质增多, TGFβ1分泌增加导致肝星状细胞增殖, 它们之间正相关, 与相关文献报道相似［7］。

本研究表明复方中药方软肝宁能延缓肝纤维化, 其机制可能是抑制TGFβ1表达其下游信号Smad2/3, 减少肝内胶原生成和沉淀, 减轻免疫损害, 降低肝脏的纤维化, 可临床推广价值此类复方中药。

参考文献

［1］ 赵辉平, 王胜春, 胡咏武, 等.五灵胶囊对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β/Smad及Ras/ERK信号通路蛋白的影响.胃肠病学和肝病学杂志, 2009, 18(5):392-396.

［2］ 陈爽, 张艳, 李孝生.川芎嗪对大鼠肝纤维化转化生长因子阻、Smad 2/3表达的影响.胃肠病学和肝病学杂志, 2013, 22(10):971-973.

［3］ Wu XL, Zeng WZ, Jiang MD, et al. Effect of Oxymatrineon the TGFbeta-Smad signaling pathway in rats with CCl4-induced hepatic fibrosis.World J Gastroenterol, 2008, 14(13):2100-2105.

［4］ 党双锁, 李亚萍.TGF-β1在肝纤维化研究中的新进展.世界华人消化杂志, 2010, 18(16):1631-1636.

［5］ Hamasaki K, Nakashima M , Naito S, et al. The sympathetic nervous system promotes carbon tetrachlo ride-induced liver cirrhosis in rats by supp ressing apop to sis and enhancing the grow thkinetics of regenerating hepatocytes. J Gast roenterol, 2001, 36(2):111.

［6］ 曹平, 刘立新, 郭晓红, 等. Smad3沉默对IGFBPrPl诱导肝星状细胞分泌细胞外基质作用的影响.中华肝胆外科杂志, 2011, 17(2):142-145.

［7］ Latella G, Vetuschi A, Sferra R, et al.Targeted disruption of Smad3 confers resistance to the development of dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in mice.Liver Int, 2009(29):997-1009.

［8］ 蔡卫民, 陶君, 翁红雷, 等.血清纤维化指标的影响因素分析.中华肝脏病杂志, 2003, 11 (1) :23.

［9］ Oberti F, Valsesia E, Pilette C, et al. No invasive diagnosis of hepatic fibrosis or cirrhosis.Gastroenterology, 1997, 113(5):1609-1616.

［10］骆抗先.肝纤维化的血清学诊断.临床肝胆病杂志, 1996, 12(1):1-2.

［11］Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, et al. Boswellia serrata and Salvia mihiorrhiza extracts reduce DMN-induced hepatic fibrosis in mice by TGF-betal downregulation. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(11):1484-1498.

［收稿日期：2014-03-20］

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