左、右归丸通过TGF-β1/Smad4 信号途径对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导的影响

何丽娟 宋 囡 何文智 孙月娇 初 杰 任艳玲

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847)

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，在体内是成骨细胞的主要来源〔1〕；在体外实验中，BMSCs诱导分化为成骨细胞得到了肯定。已经证明的诱导方法有很多〔2，3〕，但是有关中药汤剂诱导BMSCs骨向分化的报道尚不多见。左归丸的主要功效是填肾精、益骨髓，右归丸的主要功效是补命火，壮肾阳。本课题组前期体外研究已经表明左、右归丸及其拆方含药血清能协同诱导剂促进 BMSCs 成骨分化，左归丸和滋肾阴药的诱导作用优于右归丸和补肾阳药〔4〕。但是其诱导机制尚不明确。本实验通过转化生长因子(TGF)-β1/Smad4信号转导途径，进一步探讨左、右归丸对BMSCs的影响。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD大鼠20只，体重220～240 g，雌雄不限。提取和培养采用同种2月龄雄性大鼠1只。均由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。

1.2药物及试剂 中药饮片购自辽宁中医药大学附属第一医院，左归丸成分：熟地黄24 g、炒山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角胶12 g、菟丝子12 g、牛膝9 g、龟板胶12 g，右归丸成分：熟地黄24 g、炒山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角胶12 g、菟丝子12 g、当归9 g、肉桂6 g、杜仲9 g、附子6 g。将两种药方制备成水煎剂，生药量为1 g/ml。改良型 α-MEM培养液、胎牛血清(FBS)(Hyclone)；胰酶(Sigma)；抗碱性磷酸酶(ALP)抗体(博奥森)；抗-GAPDH 抗体(中杉金桥)；抗-TGF-β1、抗-Smad4抗体(Santa Cruz Biotechnology)。免疫组化及DAB试剂盒(博士德)。

1.3仪器 二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，BioSpec-nano型紫外可见分光光度计(岛津，日本)，WD-9413B凝胶成像分析仪(北京六一)；DFC320型倒置显微镜(Leica，德国)；BX53型显微镜(Olympus，日本)。

1.4方法

1.4.1含药血清制备与实验分组 将大鼠随机分为左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、补佳乐组(BJL)、空白对照组，雌雄各半，每组5只制备含药血清。按每公斤体重大鼠的给药量为成人的6.3倍计算，并且每次给大鼠灌胃量为正常人用药量的2倍，分别为左归丸组：19.1 g/kg体重、右归丸组：20.72 g/kg体重、西药组：0.38 mg/kg体重、空白对照组：1.0 g/kg体重，每日灌服2次，药物生药量为1 g/ml，空白对照组灌服蒸馏水。于第4天早晨给药2 h后，腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，大鼠腹主动脉取血，静置2 h后离心(2 500 r/min，4 ℃，20 min)并收集血清，56℃水浴灭活30 min，分装，-86 ℃保存。实验分为5组，其中Control组含10%空白对照组血清的α-MEM培养液，ZGW+YDJ组、YGW+YDJ组和BJL+YDJ组含有相对应的10%药物血清及诱导剂(YDJ，含10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μmol/L维生素C的α-MEM培养液)，YDJ组含10%YDJ。

1.4.2BMSCs分离培养 将2月龄的SD大鼠脱颈处死，然后用75%酒精浸泡15 min，移入超净台后在无菌状态下取双侧股骨和胫骨，剪下骨的两端，使骨髓腔充分暴露，用含青、链霉素的 α-MEM 培养液5 ml反复冲洗骨髓腔至骨的颜色变白为止，然后把平皿中的液体移入离心管中，离心(1 000 r/min，3 min)并弃去上清液，用含10% FBS的 α-MEM 培养液反复吹打，使细胞重悬后转入25 cm2培养瓶中，在CO2培养箱培养，细胞传代至第4代，即可用于实验。

1.4.3ALP的蛋白检测 采用 Western印迹法。P4代BMSCs 细胞接种于25 cm2培养瓶中，4 d后饥饿24 h(饥饿培养液为含0.2% FBS的 α-MEM 培养液)，加入各组培养液6 ml继续培养9 d，然后倒掉培养液，用PBS洗3遍，甩干，每瓶细胞加入PBS 1 ml，细胞刮至瓶底一角，收集至预冷的EP管中，12 000 r/min，4℃，离心10 min，弃上清，每瓶细胞加入裂解液80 μl并反复吹打10次左右，冰上静置30 min，再次离心12 000 r/min、4℃，取上清至EP管中；BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后，每孔上样品20 μl，电泳，转膜3 h，一抗37℃水浴孵育1 h后，4℃过夜，次日二抗37℃水浴孵育1 h，然后暗室中加入 ECL发光液，X光胶片曝光30 min，扫描图像并且分析结果，目的蛋白与内参GAPDH条带的光密度值作比较，得出比值后再各组比较。

1.4.4TGF-β1及Smad4免疫组化染色(SP法) P4代BMSCs细胞接种于12孔板中，12孔板中每一孔预先铺好一次性塑料细胞培养片，约5 h后(细胞已贴壁) 加入各组培养液1 ml继续培养7 d后，从12孔板中取出细胞爬片经PBS 液清洗1次，多聚甲醛固定15 min，PBS液清洗2～3次。用0.5% Triton X-100做破膜处理，再用PBS洗2～3次，每次3 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温作用20 min封闭非特异性结合点。甩去多余液体，滴加1∶50稀释的兔抗大鼠TGF-β1抗体(1抗)和1∶50稀释的小鼠抗大鼠 Smad4 抗体(1抗)，放入湿盒内4℃过夜。PBS液洗2～3次，每次3 min，滴加辣根酶标记二抗，TGF-β1为抗兔，Smad4为抗小鼠，比例均为1∶500，室温静置1 h，PBS液洗5 min共3次。DAB显色5～10 min (显微镜下掌握显色程度)，PBS液或自来水冲洗10 min，苏木精轻度复染2 min，自来水冲洗10～15 min，脱水、透明、树脂二甲苯封片，镜检。

2 结 果

2.1BMSCs形态学观察 细胞接种于培养瓶24 h后可见少量细胞贴壁，以圆形居多，透亮；4 d后可见贴壁的细胞已有大部分，并且形成突触，细胞呈现多角形或菱形时进行第一次换液；10～12 d后，细胞融合率达到80%，首次传代，细胞传到P4 代时大多呈纺锤形，旋涡状排列(图1)。

2.2左、右归丸对BMSCs的ALP蛋白表达的影响 与Control相比，ZGW+YDJ组、YGW+YDJ组、BJL+YDJ组、YDJ组都可以使 BMSCs中的ALP蛋白表达增强 (P<0.01)；与YDJ组相比，ZGW+YDJ组和YGW+YDJ组均可增强BMSCs中ALP蛋白的表达(P<0.01)，BJL+YDJ组对BMSCs中ALP蛋白的表达无明显促进作用，而与YGW+YDJ组比较，ZGW+YDJ组对BMSCs的ALP蛋白的表达也无明显促进作用(P<0.01)。见图2。

图1 BMSCs细胞形态

A～E:对照组，ZGW+YDJ组，YGW+YDJ组，BJL+YDJ组，YDJ组;与对照组比较：1)P<0.01;与YDJ组比较：2)P<0.01,gn YGW+YDJ组比较：3)P<0.01；下图同

2.3左、右归丸对BMSCs中TGF-β1蛋白表达的影响 大鼠BMSCs中TGF-β1的阳性表达位于细胞质中，呈棕黄色。与Control组相比，ZGW+YDJ组、YGW+YDJ组、BJL+YDJ组、YDJ组都可以增强BMSCs中TGF-β1蛋白表达(P<0.01)；与YDJ组相比，ZGW+YDJ组和YGW+YDJ组均可显著促进BMSCs中的TGF-β1的表达，但是BJL+YDJ组对BMSCs中TGF-β1的表达无明显促进作用(P<0.01)，而与YGW+YDJ 组比较，ZGW+YDL组对BMSCs中的蛋白的TGF-β1表达也无明显促进作用(P>0.05)。见图3。

2.4左、右归丸对BMSCs中Smad4表达的影响 大鼠BMSCs 中Smad4的阳性表达位于细胞质中，呈棕黄色。与Control组相比，ZGW+YDJ组、YGW+YDJ组、BJL+YDJ组、YDJ组都可以增强BMSCs中Smad4蛋白表达(P<0.01)；与YDJ组相比，ZGW+YDJ组和YGW+YDJ组均可显著促进BMSCs中Smad4表达(P<0.01)，但是BJL组对BMSCs中Smad4的表达无明显促进作用，而与YGW+YDJ组比较，ZGW+YDJ组对BMSCs中Smad4表达有明显促进作用(P<0.01)。见图3。

图3 TGF-β1及Smad4蛋白在BMSCs中的表达(免疫组化，×200)

3 讨 论

BMSCs具有较强的分化和增殖能力，可分化多种胚层细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞等。沈自尹院士指出，干细胞具有先天之精的属性，肾所藏之精可相应于胚胎干细胞以及其他分化为各种组织器官的成体干细胞，故BMSCs与中医之肾精相应〔5〕。左归丸和右归丸均是填补精髓、阴阳互济的代表方剂，可以促进成骨细胞中 Cbfα1、Col-Ⅰ、TGF-β1、Smad4 等蛋白的表达，可能通过调节骨重建和骨吸收治疗骨质疏松〔6〕。

ALP是成骨细胞的功能性酶，可以破坏细胞内的钙化抑制剂，从而启动钙化，是成熟的成骨细胞的早期标志〔7～9〕。本实验说明BMSCs可能通过左、右归丸协同诱导剂诱导为成骨细胞。

TGF-β1是其中一种，是TGF-β各类信号转导过程中必需的介质。很多研究显示TGF-β1在成骨细胞分化和骨重建中有重要作用〔10，11〕。Smad4 是 Smads 家族中的通用型蛋白，在TGF-β各类信号转导过程中，通过与活化的受体激活型 Smads 蛋白分子结合形成异源三聚体，完成信号由细胞膜到细胞核的应答〔12〕。杨晓〔13〕研究发现Smad4基因敲除导致成骨细胞对BMP-2和TGF-β1的反应性显著降低。本次实验研究表明，左归丸可协同诱导剂明显上调TGF-β1蛋白表达，促进Smad4蛋白的表达，而其他处理因素组相对促进作用不甚明显。本研究结果表明，左归丸和右归丸可能是通过TGF-β1/ Smad4信号表达途径影响BMSCs成骨，其具体作用机制，以及是否有MAPK信号通路中ERK1/2、p38和JNK三大信号旁路的参与，有待进一步研究。

4 参考文献

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