补肾活血方对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用

许艺惠 叶水芬 王婷婷 苏幼燕 王华金 吴良宁 蔡 晶

(福建省第二人民医院健康管理中心，福建 福州 350003)

血管性痴呆(VD)发病机制尚不清楚，目前国内外对该病也无有效的治疗方法。研究表明，多次脑卒中或长期慢性脑缺血造成神经系统的氧化应激是脑缺血损伤的主要原因之一〔1，2〕。脑缺血等病理情况下氧自由基生产增多，自由基清除酶活性降低，加重了缺血造成的神经组织损伤。由于脑组织富含对自由基敏感的多不饱和脂肪酸，极易被氧化；而且神经细胞的氧自由基清除酶含量较低，故自由基清除能力相对较弱。因此，神经细胞易受氧化应激损伤〔3〕。补肾活血方以补肾活血为立法，方中以淫羊藿温肾壮阳为君药，配以丹参等活血化瘀药物。诸药配合，补中有通，标本兼治，在临床应用具有补益脾肾、益智健脑、活血开窍之功，常用于治疗长期慢性脑缺血或脑卒中后的记忆力、计算力、判断力降低等轻中度VD的智能障碍〔4～10〕，但是相关机制尚不十分清楚。本实验拟探讨补肾活血方对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其可能的机制，为VD的临床防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料和试剂 补肾活血方购自福建省第二人民医院(含淫羊藿、丹参等)，DMEM培养基购自Gibco，胎牛血清购自Hyclone公司，H2O2购自上海试一化学试剂有限公司，MTT、DMSO、胰蛋白酶、多聚赖氨酸均购自Sigma公司，青/链霉素溶液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所，ELISA试剂盒购自上海泸峰公司(编号FA04453B、FA04426B、FA04438B、FA00459B)，β-actin(13E5)Rabbit mAb、Caspase-3 Rabbit mAb、CAT Rabbit mAb均购自Cell Signaling公司，GPx-1 Rabbit mAb购自Abcam公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物技术有限公司，cDNA逆转录用试剂盒、Green PCR master MIX(2x)均购自Fermentas公司，Trizol购自Invitrogen公司，DEPC、TBE、MARKER均购自Solarbio公司，琼脂糖BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10购自SPAIN公司，其他试剂(乙醇、异丙醇、氯仿等均为国产试剂分析纯)，PC12细胞购自中国生命科学院上海细胞所。

1.2主要仪器 生物倒置显微镜为日本OLYMPUS公司，全自动酶标仪XL800为美国Bio-Tex公司，电泳仪、电转仪、化学发光成像仪为BIO-RAD公司，PCR分析仪为Eppendorf公司。H7650型透射电镜为日立公司、400万像素电镜CCD相机为SIS公司。

1.3含药培养液的制备

1.3.1含H2O2培养液的制备 H2O2经0.22 μm微孔滤膜过滤，用GIBCO DMEM培养基配制成不同浓度的H2O2(终浓度分别为50、100、150、200、300、400、500 μmol/L)，以新鲜配制的培养液为阴性对照。4 ℃冷藏备用。

1.3.2补肾活血方水提液的制备 精密称取补肾活血方55 g，10倍量的蒸馏水,浸泡1 h,加热回流2 h，趁热过滤；第2次再加10倍量的蒸馏水加热回流提取2 h，趁热过滤；合并两次滤液，旋转蒸发仪浓缩，浓缩至10 ml备用，浓度为5.5 g生药/ml。实验中所用补肾活血方浓度均以生药量计算。

1.3.3补肾活血方醇提液的制备 精密称取补肾活血方55 g，石油烷脱脂后，用95%的乙醇索氏提取，定容至10 ml备用，浓度为5.5 g生药/ml。

实验时取补肾活血方水提液、醇提液加入DMEM培养基中，在超净台内，用0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷藏备用。

1.4细胞培养 经常规传代培养，采用GIBCO DMEM培养液，含10% Hyclone胎牛血清、2%青/链霉素溶液配制。在37℃、5 % CO2饱和湿度条件下，每天换液1次，1 w传代2次。取对数生长期的细胞进行实验。

1.5不同浓度不同时间H2O2对细胞生长的影响 取对数生长期的细胞，以5×104/L的浓度接种至96孔板中，培养24 h后加入不同浓度的H2O2(终浓度分别为50、100、150、200、300、400、500 μmol/L)，以新鲜配制的培养液为阴性对照。分别培养6、12、24、48 h后每孔加入5 mg/ml的MTT 溶液20 μl，避光培养4 h；弃上清，每孔加入150 μl的DMSO溶液，振荡10 min，自动酶标读数仪比色(主波长490 nm，次波长630 nm)，测定其吸光值，并计算各组细胞的存活率。细胞存活率/%=实验组吸光度均值/空白组吸光度均值×100%。

1.6不同浓度补肾活血方对细胞生长的影响 细胞培养方法同前，分别加入终浓度为200、400、800、1 600 μg/ml的补肾活血方水提液及醇提液，继续培养24 h，测定其吸光值。各组细胞的存活率计算方法同1.5。

1.7不同浓度不同时间补肾活血方对H2O2诱导细胞损伤的影响 细胞培养方法同前，分别加入200 μmol/L H2O2，培养24 h后弃上清，分别加入200、400、800、1 600 μg/ml水提液及醇提液，以新鲜配制的培养液为阴性对照，继续培养3、6、12、24、36、48 h后，测定其吸光值。各组细胞的存活率计算方法同1.5。

1.8分组方法和光镜观察细胞形态变化 取对数生长期的细胞，以3×105/L的浓度细胞接种于6孔板上，培养24 h后弃上清；正常组加入新鲜培养液，模型组、补肾活血方水提组、补肾活血方醇提组加入200 μmol/L H2O22 ml干预 24 h；弃上清，正常组、模型组加入新鲜培养液，补肾活血方水提组、补肾活血方醇提组分别加入终浓度800 μg/ml补肾活血方水提液及醇提液，干预24 h。倒置显微镜下观察各组细胞形态的变化。

1.9电镜观察细胞超微结构变化 各组细胞培养结束后，收集细胞；1 200 r/min离心8 min，去上清，经3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS(7.2)前固定30 min，用细针沿离心管壁轻划一圈，使固定液充分渗入底部细胞团，4 ℃静置固定数天；0.1 mol/L PBS漂洗并保存过夜；2%锇酸-3%亚铁氰化钾水溶液后固定2 h；0.1 mol/L PBS漂洗并保存过午；酒精-丙酮梯度脱水；环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片80 nm，醋酸双氧铀/柠檬酸铅双染色，日立H7650型透射电镜80 kV观察，SIS400万像素电镜CCD相机拍摄。

1.10ELLAS法检测intracellular SOR、CAT、GPx-1、GSH 各组细胞培养结束后，弃上清，PBS洗涤2次，置冰袋上，各加入细胞裂解液300 μl，裂解20 min，收集细胞于1.5 ml EP管，4 000 r/min离心10 min，转移上清于一新EP管，得细胞裂解上清液。按BCA蛋白测定试剂盒说明测定蛋白含量。严格按照各项检测试剂盒说明操作测定intracellular SOR含量及CAT、GPx-1、GSH的活性。分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μl，待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl(样品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5 次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外，37℃温育30 min。洗板5次。每孔先加入显色剂A、B各50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。每孔加终止液50 μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白空调零，450 nm波长测量各孔的吸光值(测定应在15 min以内进行)。用标准物的浓度与吸光值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的吸光值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.11Western印迹检测HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3的蛋白表达 各组细胞培养结束后，弃上清，4 ℃预冷的PBS洗涤2遍，吸干多余的PBS。置于冰上，每孔加入细胞裂解液150 μl，以移液枪反复吹打，裂解30 min。将细胞收集于1.5 ml的EP管中，14 000 r/min离心30 min，上清转移至新的EP管中。每组样品各取20 μl用BCA法测定蛋白浓度，剩余部分加入1/4体积的5×上样缓冲液，100℃水浴变性5 min；变性后取相同蛋白量(50 μg)样品，另1孔分别加入可视Marker 5 μl。恒压情况下12%SDS-PAGE电泳，100 V电泳80 min。电泳结束，卸下凝胶，按蛋白质Marker找出和目的蛋白分子量相应的凝胶位置，切胶，以半干电转移法(电转条件为3.0 mA/cm2转45 min)将蛋白转至PVDF膜上，室温下于脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。封闭结束后，分别加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；再次取出PVDF膜，TBST振摇洗膜3次，每次10 min，加入相应的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h；将PVDF膜以TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显色剂显色，放置到成像仪内，进行曝光成像，形成相应的蛋白免疫印迹。Image Lab软件半定量分析，以β-actin作为内参照。目的条带的光密度积分值V值 (V=平均吸光度值×条带面积)；计算V目的条带/Vβ-actin光密度积分值的比率(Ratio)。

1.12RT-PCR检测CAT的基因表达

1.12.1细胞总RNA的提取 采用Trizol法抽提：各组细胞培养结束后，弃上清，分别加入1 ml冰冷的Trizol，用移液器上下抽吸直到细胞充分裂解，于室温放置5 min，加入0.2 ml氯仿，上下颠倒管子混合15 s，冰浴中放置10 min，在4℃条件下以12 000 r/min离心10 min，小心将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混合后，在冰浴中放置10 min。在4℃条件下以12 000 r/min离心10 min，小心并尽可能去除全部上清液。然后用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀和管壁，7 500 g/min离心5 min，去除乙醇后将RNA室温放置干燥5 min，用20 μl无RNase污染的DEPC水将所提取的RNA溶解。采用1%的变性琼脂糖电泳、A260∶A280及A260∶A230检测所提取RNA的完整性和均一性。

1.12.2逆转录反应 20 μl的逆转录反应体系为：total RNA 2 μg、Oligo(dT)18 primer 1 μl、5×RB 4 μl、RI(20 U/μl)1 μl、dNTP Mix 2 μl、M-MLV逆转录酶1 μl、补去离子水至20 μl体积。逆转录反应条件：42℃ 1 h逆转录反应，70℃ 5 min灭活M-MLV。

1.12.3PCR反应 20 μl的PCR反应体系为：PCR Master Mix 10 μl、上游引物和下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、补去离子水至20 μl体积。PCR反应条件：CAT、 β-actin (预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 s、退火CAT 58℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共进行35个循环数，最后72℃延伸 10 min)；HO-1、GPX-1(预变性94℃ 4 min，变性94℃ 1 min、退火HO-1 58℃/GPX-1 65℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，共进行23个循环数，最后72℃延伸10 min)。PCR扩增产物5 μl于1.5%琼脂糖凝胶电泳；EB染色，用图像分析处理系统进行灰度扫描，作扫描面积积分半定量分析，以β-actin作为内参照。目的条带的光密度积分值V值 (V=平均吸光度值 ×条带面积)；计算V目的条带/Vβ-actin光密度积分值的比率(Ratio)。

表1 PCR引物序列

2 结 果

2.1不同时间和浓度的H2O2对细胞存活率的影响 见图1。各个浓度的细胞存活率均随时间有变化(F=158.87，P=0.000)。各浓度细胞存活率不等，各时间点的细胞存活率均随浓度有变化(F=823.831，P=0.000)。浓度因素与时间因素有交互作用，说明各浓度组细胞存活率的时间变化有差异(F=19.193，P=0.000)。

图1 H2O2对PC12细胞存活率的影响

从浓度上看，12.5、25 μmol/L H2O2在各个时间点均对细胞存活率无明显影响。50 μmol/L及 以上的细胞存活率均表现不同程度降低(P<0.05)。

从时间上看，1、3 h各浓度H2O2的细胞存活率均在50%以上，6 h及以上(50 μmol/L及 以上)的细胞存活率浓度均在50%以下，以15、18 h最为显著(P<0.05)。24 h中12.5、25、50 μmol/L均对细胞存活率无明显影响，200 μmol/L及以上浓度的细胞存活率均为50%以下，故选200 μmol/L H2O2干预24 h作为造模条件。

2.2不同浓度的补肾活血方对细胞存活率的影响 见图2。单独用200、400、800、1 600 μg/ml的补肾活血方水提液与补肾活血方醇提液干预24 h，对PC12细胞存活率无毒性作用。

2.3不同时间不同浓度补肾活血方对H2O2损伤的细胞存活率的影响 见图3。各时间点细胞存活率不等，即各个浓度的细胞存活率均随时间有变化(F=21.125，P=0.000)。各浓度细胞存活率不等，各时间点的细胞存活率均随浓度有变化(F=64.891，P=0.000)。从组别因素上看，两组细胞存活率不等(F=14.447,P=0.000)。浓度因素与时间因素有交互作用，说明各浓度组细胞存活率的时间变化有差异(F=2.328，P=0.000)。

图2 补肾活血方对PC12细胞存活率的影响

图3 补肾活血方对H2O2损伤细胞存活率的影响

与正常组比较，模型组细胞存活率显著降低(P<0.05)，提示H2O2能诱导PC12细胞损伤。给予不同浓度补肾活血方水提、醇提液干预3、6、12、24、36、48 h后，细胞存活率显著升高(P<0.05)，表明补肾活血方能显著降低H2O2对PC12细胞的损伤。且800 μg/ml干预24 h较明显，故选用800 μg/ml干预24 h进行实验。

2.4光镜观察细胞的形态变化 倒置显微镜下观察细胞形态的变化(图4)。结果表明正常对照组PC12细胞呈神经元突起形态，模型组细胞出现皱缩；补肾活血方水提组及补肾活血方醇提组细胞形态基本正常。

2.5电镜观察细胞的形态变化 正常组：细胞大多近圆形或椭圆形，微绒毛样突起多；膜未见破裂或细胞肿胀；核居中大而圆见单个核仁，常染色质多，异染色质散在；偶见偏位较小呈肾形。细胞质内线粒体呈短棒状，较小，较多，散在分布；可见较多嵴，未见明显断裂或消失。粗面内质网呈单条扁囊状，量中等，散在分布，未见脱颗粒现象。模型组：细胞球形，微绒毛样突起明显减少。核多见偏位，异形，明显缩小；偶见居中椭圆，略小；常染色质多，异染色质散在。细胞质内受损线粒体多见，呈空泡样，或肿胀的线粒体可见少量嵴，嵴断裂或消失；见少量固缩线粒体与溶酶体融合；溶酶体增大增多，电子密度增高，形状不一；粗面内质网为单个扁平囊，部分囊泡化，或脱颗粒，散在。补肾活血方水提组：细胞球形或椭圆形，细胞表面可见微绒毛样突起。细胞核近中部，大而椭圆，常见核仁，常染色质多，异染色质散在；偶见偏位较小呈肾形。大部分细胞线粒体基本正常，偶见线粒体水肿，嵴可见。溶酶体可见，数量不等。粗面内质网为单条扁平囊，散在，未见明显水肿，部分脱颗粒。补肾活血方醇提组：细胞球形或椭圆形，细胞表面可见微绒毛样突起。核近居中椭圆，或偏位，略小，常染色质多，异染色质散在。细胞质内线粒体卵圆形或短棒状，结构基本正常。溶酶体可见，数量不等。粗面内质网为单条扁平囊，散在，未见水肿或脱颗粒。见图5。

图4 光镜观察细胞形态变化 (×200)

图5 电镜观察细胞超微结构变化(×15 000)

2.6ELISA法检测抗氧化酶的活力 与正常组比较，模型组细胞中SOR含量显著增多，CAT、GPx-1、GSH的活力均有显著下降；与模型组比较，补肾活血方组细胞中SOR含量显著减少，CAT、GPx-1、GSH的活力均有显著提高，且醇提组较为明显；以上差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.7Western 印迹检测HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3的蛋白表达 与正常组比较，模型组细胞中CAT表达稍下调，HO-1、GPx-1表达明显下调，Caspase-3表达显著增高；与模型组比较，补肾活血方组HO-1、CAT、GPx-1表达上调，Caspase-3表达下调，且醇提组略明显(P<0.05)(见表3，图6)。

表2 补肾活血方对H2O2诱导PC12细胞氧化应激的影响±s)

表3 补肾活血方对HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3蛋白表达的影响±s，n=6)

2.8RT-PCR检测HO-1、CAT、GPx-1的基因表达 与正常组(0.22、0.15、1.44)比较，模型组细胞中HO-1、CAT、GPx-1基因的表达水平(0.05、0.07、1.00)下调；与模型组比较，补肾活血方水提组HO-1、CAT、GPx-1基因的表达水平(0.12、0.08、1.60)上调，醇提组上调更明显(0.21、0.17、1.75)(P<0.05) 。见图7。

图6 补肾活血方对HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3蛋白表达的影响

图7 补肾活血方对HO-1、CAT、GPx-1、基因表达的影响

3 讨 论

中医理论认为“肾藏精，精生髓上充于脑”。肾精充足上充脑髓，则神机精灵；若肾精匮乏脑髓空虚，则神呆智钝。补肾中药有固精益肾的作用，是临床常用的健脑益髓药物。补肾活血方以补肾活血为立法，通过临床用药的经验，结合本课题组前期对淫羊藿等多种单味补肾中药的研究〔4，5〕，以及相关文献报道肉苁蓉、黄精、丹参酮对神经细胞损伤有保护作用〔6～8〕，选择效果较好的3种补肾中药加上活血化瘀药组成。方中以肉苁蓉为君药，取其补肾阳、益精血的阴阳双补功效；淫羊藿温补肾阳，配合肉苁蓉温补肾阳，为臣药；制黄精滋补肾阴，以求阴中求阳；丹参活血化瘀，既祛瘀血，又令诸补益药滋而不腻，同为佐药。诸药配合，补中有通，标本兼治，具有补益脾肾、益智健脑、活血开窍之功。

近年研究表明VD与氧化应激和氧自由基损伤、线粒体失能有密切的关系。H2O2能产生大量氧自由基引起氧化应激反应，常用于诱导细胞氧化应激。它可导致细胞膜的脂质过氧化，降低细胞膜的流动性，改变胞内蛋白质成分和活力，最终导致细胞的损伤〔11〕。

本研究发现在同一浓度，H2O2处理时间越长细胞存活率越低；在一定浓度范围内，随着H2O2浓度增高，细胞存活率逐渐降低。这与以往的研究一致〔12〕，表明H2O2确实能诱导细胞损伤，且具有浓度和时间依赖性。

血红素加氧酶(HO)可催化产生内源性一氧化碳(CO)，对减轻氧化损伤具有重要意义。其中HO-1是诱导型，在氧化应激状态下可被诱导产生，通过加强降解血红素、胆红素等产生CO，参与调节机体病理状态的多种反应〔13〕。超氧化物歧化酶是机体抗氧化反应的重要防御系统，其中包括CAT、GPx-1和GSH等，可催化或清除H2O2，避免产生毒性更强的·OH。谷胱甘肽与其他巯基化合物还可以保持细胞内氧化还原平衡，从而抑制氧化损伤〔14〕。

在缺氧环境中，组织内氧自由基增多，代谢紊乱，引起细胞损伤,相关的抗氧化酶减少，细胞凋亡相关因子Caspase-3可被激活〔15～18〕。Liu 等〔19〕用H2O2诱导PC12细胞损伤，发现模型组细胞存活率及SOD、CAT、GPx-1等的活性显著下降，Caspase-3活性显著升高。本实验结果也提示补肾活血方通过提高抗氧化酶的活性发挥其对H2O2损伤PC12细胞的拮抗作用。

Solaleh等〔20〕用H2O2诱导PC12细胞损伤，发现与模型组比较，药物干预组HO-1、GPx-1等蛋白表达显著升高。本实验中，药物干预组HO-1、CAT、GPx-1蛋白表达。这与以往研究一致，提示其神经保护作用可能是通过上调抗氧化酶的表达，发挥抗氧化应激作用来实现。Omotayo等〔21〕用大鼠研究肾氧化应激，发现药物组CAT、GPx-1 mRNA表达升高。本实验中，补肾活血方组HO-1、CAT、GPx-1 mRNA表达。这与以往研究一致，提示补肾活血方可能通过提高抗氧化酶的基因表达减轻氧化损伤。Siddiqui等〔22〕用4-羟基壬烯酸诱导PC12产生氧化应激损伤，模型组Caspase-3蛋白表达及mRNA表达升高。Zhou等〔23〕用活性氧诱导PC12损伤，药物干预组通过降低Caspase-3和Bax的表达减轻氧化应激。本实验中，补肾活血方组中Caspase-3蛋白表达及mRNA表达降低，这与以往研究一致。

综上所述，补肾活血方能够提高H2O2损伤后的细胞存活率；明显减轻H2O2引起的细胞形态变化和细胞超微结构变化；减少SOR含量，提高HO-1、CAT、GSH、GPx-1等抗氧化酶的活性，降低Caspases-3的活性。

4 参考文献

1Bennett S，Grant MM，Aldred S.Oxidative stress in vascular dementia and Alzheimer′s disease：a common pathology〔J〕.J Alzheimers Dis，2009;17(2):245-57.

2Zhu X，Smith MA，Honda K，etal.Vascular oxidative stress in Alzheimer disease〔J〕.J Neurol Sci，2007;257(1-2):240-6.

3Satoh T,Enokido Y,Aoshima H,etal.Changes in mitochondril membrane potential during oxidative stress-induced apoptosis in PC12 cell〔J〕.J Neurosci Res,1997；50(3):413-20.

4田 允，蔡 晶，陈旭征，等.补肾中药对帕金森病模型小鼠置质-纹状体神经元的保护作用〔J〕.海峡科学，2010；10：273-5.

5林少刚.补肾中药干预MES23.5多巴胺能神经细胞凋亡的研究〔D〕.中国优秀硕士学位论文全文数据库，2012：1-46.

6王 虎，李文伟，蔡定芳，等.肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型的保护作用〔J〕.中西医结合学报，2007；5(4)：407-11.

7王玉勤，吴晓岚，张广新，等.黄精多糖对大鼠抗氧化作用的实验研究〔J〕.中国现代医生，2011；49(5)：6，11.

8何丽娜，杨 军，姜 怡，等.丹参酮对培养PC12细胞损伤模型的保护作用〔J〕.中国中药杂志，2001；26(6)：413-6.

9蔡 晶，杜 建，黄俊山，等.补肾健脾养血活血法治疗血管性痴呆33例临床观察〔J〕.中医杂志，2003；44(10)：752-3，785.

10Xifei Liu，Jian Du，Jing Cai，etal.Clinical systematic observation of Kangxin capsule curing vascular dementia of senile kidney deficiency and blood stagnation type〔J〕.J Ethnopharmacology，2007；112：350-5.

11Chai XY,Li FF,Bai CC,etal.Three new acylated glycosides from the stems of Casearia velutina and their protective effect againse H2O2-induced impairment in PC12 cells〔J〕.Planta Med,2010；76(1):91-3.

12Hang SL,Yen GC.Neuroprotective effects of the citrus flavanones against H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells〔J〕.J Agric Food Chem,2008；56(3):859-64.

13Grochot-Przeczek A，Dulak J，Jozkowicz A.Haemoxygenase-1：non-canonical roles in physiology and pathology〔J〕.Clin Sci (Lond)，2012;122(3):93-103.

14Rybka J，Kupczyk D，Ke dziora-Kornatowska K，etal.Age-related changes in an antioxidant defense system in elderly patients with essential hypertension compared with healthy controls〔J〕.Redox Rep，2011;16(2):71-7.

15Melo A，Monteiro L，Lima RM,etal.Oxidative stress in neurodegenerative diseases：mechanisms and therapeutic perspectives〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2011；2011:467180.

16Wang X，Michaelis EK.Selective neuronal vulnerability to oxidative stress in the brain〔J〕.Front Aging Neurosci，2010；2：12.

17Wang J，Sun P，Bao Y,etal.Vitamin E renders protection to PC12 cells against oxidative damage and apoptosis induced by single-walled carbon nanotubes〔J〕.Toxicol In Vitro，2012；26(1):32-41.

18Kwon SH，Hong SI，Jung YH,etal.Lonicera japonica THUNB.protects 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity by inhibiting activation of MAPKs，PI3K/Akt，and NF-kappaB in SH-SY5Y cells〔J〕.Food Chem Toxicol，2012；50(3-4):797-807.

19Liu CS,Chen NH,Zhang JT.Protection of PC12 cells from hydrogen peroxide-induced cytotoxicity by salvianolic acid B，a new compound isolated from Radix Salviae miltiorrhizae〔J〕.Phytomedicine，2007；14(7-8):492-7.

20Solaleh KT,Niloufar A,Mohse A,etal.Attenuation of NF-kB and activation of Nrf 2 signaling by 1,2,4-triazine derivatives，protects neuron-like PC12 cells against apoptosis〔J〕.Apoptosis,2010；15：738-51.

21Erejuwa OO,Sulaiman SA,Ab Wahab MS,etal.Honey supplementation in spontaneously hypertensive rats elicits antihypertensive effect via amelioration of renal oxidative stress〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2012;2012:374037.

22Siddiqui MA，Kumar V，Kashyap MP，etal.Short-term exposure of 4-hydroxynonenal induces mitochondria-mediated apoptosis in PC12 cells〔J〕.Hum Exp Toxicol，2012；31(4):336-45.

23Zhou LJ，Zhu XZ.Reactive oxygen species-induced apoptosis in PC12 cells and protective effect of bilobalide〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2000；293(3):982-8.