牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人主动脉内皮细胞IL-10和MCP-1表达的影响

吴 贇 陈 凌 汪义永 魏 斌

(福建医科大学附属第一医院口腔科，福建 福州 350004)

大量的流行病学调查和严格的临床对照统计分析，显示牙周感染与动脉粥样硬化(AS)密切相关〔1〕。牙龈卟啉单胞菌(Pg)是一种革兰阴性厌氧菌,是目前公认的牙周炎可疑致病菌，研究证实能够促进AS的发生和发展〔2〕。细胞因子表达调节异常在动脉粥样硬化发展过程中，发挥着关键作用。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1可在多种细胞中表达〔3〕。白细胞介素(IL)-10是重要的炎症调控因子，具有抗炎和免疫调节作用,小鼠AS模型已证实IL-10能显著抑制泡沫细胞对脂肪颗粒的摄取,从而减少或延缓泡沫细胞的形成〔4〕。本实验通过观察Pg的脂多糖(LPS)对人主动脉内皮细胞(HAECs)在mRNA转录和蛋白质翻译水平表达MCP-1、IL-10的影响,探讨Pg促进AS发生发展的可能机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂、仪器 新生牛血清(GIBCO，美国),Pg LPS(晶美生物工程公司), MCP-1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(北京博凌科为生物科技),逆转录试剂盒(Promega, 美国),凝胶成像分析系统 (上海培清科技有限公司)，PCR扩增仪 (Heraeus 公司, 德国)。

1.2细胞培养 取原代HAECs(Scien Cell公司, 美国)接种于含生长因子、青链霉素和50 ml/L胎牛血清的内皮细胞培养基中，标准环境下复苏并培养至形成单层,待铺满培养板底70% 左右时，消化传代，取4～6代细胞用于实验。

将生长良好的HAEC接种于6孔培养板，接种细胞浓度为1×105/ml，孵育24 h贴壁后，当生长汇合度达到85%时弃原培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次加入Pg LPS，分LPS 150 ng/L，LPS 100 ng/L，LPS 10 ng/L，空白对照组。

1.3ELLSA法测定MCP-1、IL-10的表达 12 h后取细胞上清，标本离心去除悬浮物后用于检测。ELISA法按照试剂盒说明操作，加入终止液后在450 nm波长测量各反应孔的吸光值(OD值)并绘制曲线，计算相应的MCP-1、IL-10浓度值。

1.4HAECs中MCP-l、IL-10基因的RT-PCR检测

1.4.1细胞RNA的提取与分离 使用Trizol提取总RNA，按RNA提取试剂盒说明进行。取适量的RNA分别进行定量与琼脂糖凝胶电泳，鉴定提取效果，确定提取的RNA的质量和浓度。根据浓度计算出2 μg RNA的体积。按照逆转录试剂盒的流程进行逆转录。

1.4.2PCR检测 引物序列如下：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH):正义5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC- 3′,反义5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,扩增片段452 bp，退火温度63℃。MCP-1引物序列:正义TCATGCACATCCTCACTCGT,反义CGGGATCTGTTTCTTTGCAT, PCR 扩增产物长度为297 bp，退火温度55℃。IL-10引物：正义5′-AGCCTACATGACAATGAAGA-3′,反义5′-GGTTGAGGTATCAGAGGTAAT-3′产物长度为180 bp，退火温度59℃。退火30 s, 72℃延伸1.5 min,共30个循环,72℃延伸7 min。

1.4.3PCR产物分析 将PCR产物与上样缓冲液以5∶1混合后在PCR 仪上扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶图像分析仪拍照并分析图像。以目的基因 mRNA 扩增后产物的吸光度值与内参照GAPDH mRNA扩增后产物吸光度值的比值作为mRNA表达的相对值, 得到MCP-1、IL-10 mRNA表达的相对含量。

2 结 果

2.1ELLSA法检测结果 在一定范围内HAECs中MCP-1的分泌量随着LPS的浓度增加而增加，100 ng/L、150 ng/L Pg-L PS作用下HAECs MCP-1的分泌量与空白对照组相比明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，IL-10分泌量随着LPS的浓度增加而降低,各实验组与空白对照组相比有显著性差异，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2电泳图谱 见图1，图2。

2.3各组MCP-1和IL-10 mRNA比较 10 ng/LPg LPS作用时，HAECs MCP-1 mRNA的表达没有明显改变(P>0.05)，100 ng/L、150 ng/L Pg LPS作用下HAECs MCP-1 mRNA的表达与空白对照组相比明显增高(P<0.05)。以 0、10、100、150 ng/L的梯度LPS 作用时，HAECs IL-10 mRNA的表达逐步减弱(P<0.05)。见表2。

表1 各组MCP-1、IL-10蛋白含量比较±s,n=6,pg/ml)

1:空白对照组;2: IPS 10 ng/L 组;3:LPS 100 ng/L 组;4:LPS150 ng/L 组

1:LPS 150 ng/L组; 2:LPS 100 ng/L 组; 3:LPS 10 ng/L组;4:空白对照组

表2 各组MCP-1和IL-10 mRNA水平比较±s,n=6)

3 讨 论

AS是一种多因素疾病，炎症反应贯穿于AS的启动形成和发展，在AS的发生和发展过程中扮演着极为重要的角色〔5〕。

Pg是目前公认的牙周炎可疑致病菌。内毒素是其细胞外膜上的主要致病成分，其化学本质为LPS，在牙周病的炎症启动和进展中发挥了重要作用。多个研究显示牙周炎会导致血液中LPS水平升高〔6〕。Ebersole等〔7〕对妊娠期牙周炎群体的研究中测出血液中LPS的含量为38～1 500 pg/ml；Pussinen等〔8〕报道随着探诊出血(BOP)位点增加，血清LPS水平上升。在牙周治疗甚至是在咀嚼时都能释放Pg及其LPS入血，提升循环LPS的水平，引起局部和全身炎症并作用于血管内皮〔9〕。

MCP-1在AS病变组织中激活，被认为是调节炎症反应基因转录的关键因子之一，与构成AS病变的3种主要细胞(单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞)均有密切关系。通过小鼠造模实验研究同样也证实MCP-1参与免疫炎症反应,进而造成动脉壁内皮细胞损伤，故认为该基因的表达构成了AS发病的重要机制〔10〕。IL -10是一种由多种细胞分泌的多功能细胞因子,能抑制T细胞、巨噬细胞激活,抑制多种炎症因子、生长因子的合成,并促进其他抗炎因子的分泌, 是一 种理想的抗炎物质。研究表明AS及再狭窄的发生与多种细胞因子介导的炎症反应密切相关,IL-10可能在AS和再狭窄的发生发展中发挥重要的保护作用。有实验表明,IL-10不仅抑制单核/巨噬细胞的贴壁,还能抑制一些黏附细胞因子及趋化因子的产生和功能的发挥〔11〕。

课题组前期研究发现Pg在AS斑块及龈下菌斑中均有较高检出率，深入分析后发现两者存在极高相似度，认为两者具有高度同源性，证实了Pg在AS发生发展中可能起着重要的作用。本实验进一步通过体外细胞实验观察Pg中LPS 对HAECs在mRNA转录和蛋白质翻译水平表达MCP-1、IL-10的影响。研究发现在一定浓度范围内,Pg中LPS呈剂量依赖性促进HAECs细胞MCP-1的表达，同时减低IL-10的表达水平，推测Pg可能通过其入血的LPS诱导血管内皮表达MCP-1、抑制IL-10的产生，导致单核细胞激活,从而促进冠状动脉AS的发生，但其具体作用机制有待进一步研究。

4 参考文献

1Persson GR, Persson RE. Cardiovascular disease and periodontitis: an update on the associations and risk〔J〕. J Clin Periodontol，2008；35(8 Suppl): 362-79.

2Zhang MZ, Li CL, Jiang YT,etal. Porphyromonas gingivalis infection accelerates intimal thickening in iliac arteries in a balloon-injured rabbit model〔J〕. J Periodontol，2008;79(7):1192-9.

3Rollins BJ.Chemokines〔J〕. Blood,1997;90(3):909-28.

4Potteaux S, Esposito B, van Oostrom O,etal. Leukocyte-derived interleukin 10 is required for protection against atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor knockout mice〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004;24(8):1474-8.

5Tuttolomondo A, Di Raimondo D, Pecoraro R,etal.Atherosclerosis as an inflammatory disease〔J〕. Curr Pharm Des,2012;18(28):4266-88.

6Hayashi J, Masaka T, Ishikawa I. Increased levels of soluble CD14 in sera of periodontitis patients〔J〕. Infect Immun,1999;67(1): 417-20.

7Ebersole JL, Stevens J, Steffen MJ,etal. Systemic endotoxin levels in chronic indolent periodontal infections〔J〕. J Periodontal Res,2010;45(1):1-7.

8Pussinen PJ, Vilkuna-Rautiainen T, Alfthan G,etal. Severe periodontitis enhances macrophage activation via increased serum lipopolysaccharide〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004;24(11): 2174-80.

9李厚轩,闫福华,雷 浪 . 牙龈卟啉单胞菌脂多糖对泡沫细胞凋亡基因的影响〔J〕 . 中华口腔医学杂志,2010;45(5): 274-8.

10Lafaurie GI,Mayorga-Fayad I,Torres MF,etal.Peri-odontopathic microorganisms in peripheric blood after scaling and root planning〔J〕. J Clin Periodontol,2007;34 (10):873 - 9.

11郭世杰,王 林,吴存瑾. 牙龈卟啉单胞菌-脂多糖对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响〔J〕. 中国循环杂志,2013;28(8): 614-7.