梗阻性黄疸大鼠肾脏水通道蛋白2、内皮素-1表达变化

韩继龙 王 勇 刘金钢

(沈阳医学院附属第二医院普外科，辽宁 沈阳 110002)

临床上梗阻性黄疸病人围术期并发症和死亡率明显高于无黄疸者。其突出的并发症和重要的死亡原因就是急性肾衰竭(ARF)，发生率达8%～10%，然而死亡率却可高达82%〔1〕。肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)作为目前临床上检测肾功能损害的指标，当它们增高时肾功能已受到严重损害，增加了临床治疗困难〔2，3〕。水通道蛋白(AQP)具有特异性强，功能专一，定位准确等特点，作为肾功能损害早期改变的研究指标是适合的〔4〕。研究发现，虽然肾脏75%的水在肾近曲小管和直小管降段重吸收，但自由水的调节却在集合管〔5〕。所以肾脏水代谢功能受到集合管的AQP表达变化的控制〔6〕，AQP2就位于肾集合管，从而明确AQP2在梗阻性黄疸时表达变化极为重要。在梗阻性黄疸时，ARF的病理过程中，内皮素(ET)-1作为最强烈的血管收缩因子，发挥重要作用，在梗阻性黄疸时，既往实验证实其增加并导致肾功能损害〔7〕。然而它在肾集合管表达有何变化，其表达变化是否对AQP2表达有影响尚未见报道。本实验观察梗阻性黄疸大鼠模型肾集合管AQP2和ET-1表达及相关性。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 雄性Wistar大鼠80只，体重250～300 g，随机分成假手术组和梗死性黄疸(梗黄)组各40只，对应术后时间分为3、5、7、10、14 d组，每组8只。处死实验大鼠对应术后3、5、7、10、14 d，处死前抽血化验直接胆红素(DBIL)、BUN、Cr。肾髓质标本取出后放在液氮中保存，然后再转至-80℃冰箱中冷冻保存。

1.2主要试剂 AQP2一抗(兔抗鼠SA1072)、二抗(羊抗兔SA1076)；ET-1一抗(兔抗鼠SA1062)、ET-1二抗(羊抗兔SA1066)及显色剂由武汉博士德生物制剂有限公司提供。

1.3生化检测及病理组织形态学观察 检测实验动物血标本中DBIL、BUN、Cr值。对肾髓质标本用HE染色制片，100倍光镜观察。

1.4免疫组织化学观察 实验大鼠肾髓质标本AQP2及ET-1的测定采用免疫组化ABC法。在光学显微镜100倍视野下，采用CMIAS图像分析系统，每个标本随机选取5个视野，测量其光密度(OD)值后取均数。

1.5统计学处理 应用SPSS15.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1肾脏形态学改变 假手术组细胞排列规则，间质无炎性细胞浸润。梗黄组肾脏颜色晦暗而无光泽，明显肿胀。肾集合管上皮细胞水样空泡变性、3 d排列不规整、肿胀、脱落，7 d还可见局灶上皮细胞坏死，14 d间质有大量炎性细胞浸润，胞质崩解。见图1。

2.2生化指标改变 Cr在梗黄组10、14 d时明显高于假手术组，BUN在梗黄组14 d明显高于假手术组，DBIL在梗黄组较假手术组明显增高，生化指标随梗阻时间延长呈上升趋势(表1)。

2.3免疫组化结果 术后5 d开始梗黄组AQP2在肾集合管表达较手术组明显减少(P<0.05)，且随梗阻时间增加其减少。见表2。假手术组胞质褐染明显，整个胞质均褐染。梗黄组3 d胞质褐染明显，但较假手术组减轻。梗黄组7 d胞质褐染减轻，厚度变薄；14 d胞质褐染区明显变小，仅少量褐染。见图2。ET-1表达在梗阻3 d后较假手术组显著增加(P<0.05)，且随梗阻时间延长而增加更加明显。见表2，图3。

2.4梗黄组AQP2和ET-1表达相关性 AQP2与ET-1呈明显负相关(r=-0.94,P=0.000 0)。

表1 各组血清DBIL、Cr、BUN值比较±s)

表2 各组肾集合管AQP2、ET-1的OD值比较±s)

图1 各组肾集合管形态学(HE，×100)

图2 各组肾集合管AQP2表达免疫组化结果(×100)

图3 各组肾集合管ET-1表达免疫组化结果(×100)

3 讨 论

梗阻性黄疸是肝外胆道及胰腺疾病常见的重要表现之一，黄疸的发生造成病人围术期并发症和死亡率升高。其中ARF是主要的并发症，也是重要的死亡原因之一。临床上反映肾功能损害的指标为Cr和BUN，而当它们发生改变时肾功能损害已较严重。人体内一些组织器官对于水有很强的渗透能力，人们预测在细胞膜上可能存在特殊的水通道，但直到1991年Agre等〔8〕对第一个AQP基因的cDNA分子进行克隆，并对其功能进行鉴定，其在哺乳动物的细胞膜上的存在才被证实。水主动跨膜转运的介质为AQP〔9，10〕。由于AQP的发现，自由水的跨膜转运问题得到了合理的解释。它是水代谢的重要蛋白质，具有特异性强，功能专一，定位准确等特点，作为肾功能和结构损害早期改变的研究指标是适合的〔11〕。近来各种原因引起的急、慢性肾衰竭时其变化得到广泛研究〔12〕。目前了解在肾脏中AQP有多种亚型分布。肾脏集合管主细胞管腔侧和胞内囊泡内主要分布的是AQP2，成为肾脏集合管水代谢的主要载体。多种先天或后天疾病与AQP2异常有关，在尿液浓缩中对水的重吸收有重要作用〔13〕。研究梗阻性黄疸时AQP表达变化，有利于明确梗阻性黄疸时肾损伤部位、程度，还可对损伤机制进行探讨。AQP2表达减少的同时发现肾集合管细胞改变，从而使肾集合管水的重吸收和尿的浓缩功能受到影响，造成肾功能损害〔14〕。在这个时期加以预防，可以大大降低梗阻性黄疸围术期肾衰竭发生。因此AQP2可作为肾功能损害早期检测指标〔15〕。

ET-1对肾脏水钠调节机制仍不明确。部分学者认为：ET-1作为局部激素(肾内)的主要作用是利尿利钠〔16，17〕。影响髓袢、集合管对尿液的浓缩功能〔18〕。研究表明在ET-1增高时，除了造成集合管细胞Na+-K+-ATP酶泵失活，使集合管内Ca2+增多，影响细胞代谢，加速细胞坏死以外，还影响肾小球血流动力学〔19〕。实验证实梗阻性黄疸大鼠早期尿量增加，且其不随入液量的减少而减少〔20〕。梗阻性黄疸早期尿浓缩功能下降的重要因素之一就是肾髓质ET-1水平的升高，使已减少的体液量进一步丧失，从而进一步加重了肾功能损害。目前还无法确定AQP2的减少就是由于ET-1的增加而导致。从ET-1的损伤机制看，由于它直接作用于肾脏集合管细胞，使其Na+-K+-ATP酶泵失活，使集合管内Ca2+增多，影响细胞代谢，加速细胞坏死。可能是AQP2减少的原因。可在梗阻性黄疸时阻断ET-1的增加，从而观察AQP2表达变化以进一步证实。

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