人端粒酶逆转录酶siRNA诱导宫颈鳞癌耐药细胞株SiHa/DDP凋亡的分子机制研究

王 艺 陈金石 李隆玉 李 凌

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其中宫颈鳞癌约占80%～90%。虽然目前对于宫颈鳞癌的治疗效果取得了显著进步，但晚期及复发性宫颈鳞癌患者治疗效果及预后却不够理想。随着恶性肿瘤多学科综合治疗模式的转变，基因治疗倍受瞩目。因此，探索宫颈鳞癌基因治疗具有重大意义。本研究将hTERT SiRNA导入耐药宫颈鳞癌SiHa/DDP细胞株后，采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA含量、流式细胞仪检测细胞凋亡、MTT法检测细胞凋亡变化，并将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈鳞癌耐药细胞株SiHa/DDP：由四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院遗传实验室刘珊玲教授惠赠。hTERT SiRNA由Invitrogen公司构建。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和合成 目的基因hTERT及内参照基因的PCR引物采用Primer5引物设计软件，并经GeneBank Blast进行同源性比较，确定其特异性，引物序列：hTERT上游引物，5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’；GAPDH上游引物，5’-CGTGGTTTCTGTGTGGTGTC-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’。由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2.2 细胞实验分组 实验分为4组：空白对照组(A组)，脂质体对照组(B组)，Negative Control siRNA对照组(C组)，转染组(D组)[hTERT SiRNA与脂质体混合液转染SiHa/DDP细胞组(荧光定量PCR检测各组细胞hTERT mRNA实验时，该组有SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3小组)]。不同时间点收集各组细胞进行相关检测，重复3次，每个指标检测设置3复孔。

1.2.3 SiHa/DDP细胞培养 培养瓶含有10%胎牛血清的DMEM培养液，每毫升加2微克顺铂的混合液，置37 ℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养。

1.2.4 设计并化学合成hTERT siRNA 根据Genebank中的hTERT基因序列，遵守siRNA设计原则并参考相关文献，设计了三对长度均为21bp的siRNA链，并由美国Invitrogen公司上海分部协助合成，Negative Control siRNA正义链，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’；……