HPLC法测定感冒退热颗粒中表告依春和连翘苷

李 丹，闫 静

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040)

感冒退热颗粒由大青叶、板蓝根、连翘、拳参4味中药组成，收载于2010年版《中国药典》一部[1]，具有清热解毒、疏风解表的主治功效.连翘苷是连翘抗微生物的主要有效成分之一，有明显的抗炎、解热及肉毒素中和作用[2].表告依春是板蓝根抗病毒的有效成分之一[3]，是衡量板蓝根质量的一个重要指标，同时也是反映感冒退热颗粒质量的重要指标.目前，感冒退热颗粒的质量标准中载有连翘苷的含量测定，以及用薄层色谱法来鉴定大青叶和板蓝根中均含有的靛玉红，却并没有控制板蓝根质量的专属标准.本实验建立了HPLC法同时测定感冒退热颗粒中的表告依春和连翘苷的含量，为该药的质量控制提供参考.

1 仪器与试剂

1.1 仪器与主要设备

戴安UltiMate3000高效液相色谱仪(色谱工作站：CHROMELEON; UV:VWD-3400; Pump：LPG-3400A;ColumnOven:TCC-3000;Sampler:WPS-3000)；Ultimate XB-C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm; Welch Materials, Inc.)；XS105 DualRange分析天平(瑞士METTLER TOLEDO)；BSA224S分析天平(德国sartorius).

1.2 试剂与对照品

乙腈(色谱纯，DIKMA TECHNOLOGIES INC.)；娃哈哈纯净水；磷酸(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；连翘苷对照品(中国食品药品检定研究所，批号：110821-201112)；表告依春对照品(上海友思生物技术公司).

1.3 实验样品

感冒退热颗粒(修正药业集团长春高新制药有限公司，批号：000908；上海雷允儿药业有限公司，批号：121102；浙江泰康药业集团新余制药有限公司，批号：110724；云南永安制药有限公司，批号：120302；江西九连山药业有限公司，批号：20130129).

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm; Welch Materials, Inc.)；流动相：乙腈-0.02%磷酸水溶液(23∶77)；检测波长235 nm；流速：1.0 mL/min；柱温为35 ℃.理论塔板数以表告依春计算不低于5 000.

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制

分别取表告依春对照品与连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含表告依春2.126 μg、连翘苷19.962 μg的对照品混合溶液，即得.

2.2.2 供试品溶液的配制

取装量差异项下的修正药业集团长春高新制药有限公司生产的感冒退热颗粒，研细，取约4 g或1 g(无蔗糖)，精密称定，用甲醇加热回流2次，各25 mL，每次回流30 min，滤过，用15 mL甲醇分次洗涤滤渣及滤器，合并滤液及洗液，蒸干，用稀乙醇10 mL使残渣溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，内径1 cm，3 g)上，加稀乙醇70 mL洗脱，把收集的洗脱液蒸干，用50%甲醇使残渣溶解，转移至25 mL的容量瓶中，加50%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

2.2.3 阴性对照溶液的配制

按处方称取除连翘和板蓝根外的其他药材，按照感冒退热颗粒的处方比例、制备工艺以及供试品的制备方法配制阴性对照溶液.分别进对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各15 μL于高效液相色谱仪，色谱图见图1.

A—对照品；B—样品(1—表告依春；4—连翘苷)；C—阴性对照图1 高效液相色谱图

2.3 线性关系

精密吸取混合对照品溶液5，10，15，20，25 μL进样，按“2.1”项下的色谱条件测定其峰面积.分别以对照品进样量(μg)、峰面积为横、纵坐标，绘制标准曲线，回归方程分别为，表告依春：y=102.98x+0.0429，R=0.999 9；连翘苷：y=24.258x+0.034，R=0.999 9.结果表明表告依春在线性范围0.010 63～ 0.053 15 μg内关系良好；连翘苷在线性范围0.099 81～0.499 05μg内关系良好.

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液15 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，重复进样6次，分别记录其峰面积值，结果表告依春峰面积的RSD值为0.46%；连翘苷峰面积的RSD值为0.49%.

2.5 稳定性试验

取修正药业集团长春高新制药有限公司生产的感冒退热颗粒，按照“2.2.2”项下的方法配制成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样分析，每次进样15 μL，测定其峰面积，表告依春峰面积的RSD值为0.24%；连翘苷峰面积的RSD为0.26%.结果表明样品12 h内稳定.

2.6 重复性试验

取修正药业集团长春高新制药有限公司生产的感冒退热颗粒，平行精密称取6份，按照“2.2.2”项下的方法配制成供试品溶液，每份进样15 μL，测定其峰面积，结果含表告依春平均量为0.32 mg·袋-1，RSD值为1.06%；含连翘苷平均量为2.34 mg·袋-1，RSD值为0.51%.

2.7 加样回收率试验

取已知表告依春及连翘苷含量的感冒退热颗粒(修正药业集团长春高新制药有限公司)，平行精密称取9份，分为3组，各加入一定量的混合对照品，按“2.2.2”项下的方法制备样品溶液，进样15 μL，结果见表1、2.

表1 感冒退热颗粒中表告依春加样回收率结果(n=9)

表2 感冒退热颗粒中连翘苷加样回收率结果(n=9)

2.8 样品含量测定

取不同生产厂家的感冒退热颗粒，依“2.2.2”项下的方法配制成供试品溶液，按上述色谱条件测定其峰面积，以外标法分别计算各样品中含表告依春及连翘苷的量，结果见表3.

表3 不同生产厂家的感冒退热颗粒中含表告依春和连翘苷量(n=3)

3 讨 论

《中国药典》2010年版一部记载感冒退热颗粒的标准，是以连翘中连翘苷的含量计算[1]，但板蓝根作为感冒退热颗粒的君药，并无专属标准，并且不同厂家生产的感冒退热颗粒中含表告依春的量相差较大，故本实验建立了HPLC法同时测定含表告依春和连翘苷的量，用以衡量感冒退热颗粒的质量.

本实验选择波长190～400 nm范围内进行检测，通过直观比较，发现在235 nm波长处表告依春和连翘苷的吸收均较大，并且两峰理论塔板数值均不低于5 000，因此选用235 nm为检测波长.

本实验考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.02%磷酸水溶液，乙腈-0.02%磷酸水溶液(加少许三乙胺)等多种溶剂洗脱系统，结果发现乙腈-0.02%磷酸水溶液为流动相时两峰的峰型最好；分别对比了不同流动相比例的等度洗脱和梯度洗脱，结果以乙腈-0.02%磷酸水溶液为23∶77等度洗脱时，两峰的峰型和分离度最好，其原因可能是少许的磷酸能抑制物质的电离，使其维持在一个稳定的状态，从而改善峰型和分离度.故流动相选择乙腈-0.02%磷酸水溶液(23∶77).

表告依春虽为水溶性成分，但用纯水提取时，其稳定性较差，当加入乙醇提取时，其稳定性随着乙醇的比例增大而加强[4]，结合2010年版《中国药典》连翘苷供试品溶液制备的方法[5]，选用甲醇进行提取，经过处理后用50%甲醇配制，进入液相色谱仪得出结果其基线平稳，峰型较好，理论塔板数高.

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典:一部[M]. 北京: 化学工业出版社, 2010: 191,1185.

[2]李 双，王东强，李志军.连翘主要有效成分的提取与药理作用[J].黑龙江中医药，2011，40(2)：46-48.

[3]徐丽华，黄 芳，陈 婷，等.板蓝根中的抗病毒活性成分[J].中国天然药物，2005, 3(6):359-360.

[4]张 叶，张 蕾，王 玉.RP-HPLC法测定板蓝根药材中腺苷和表告依春的含量[J].药物分析杂志，2008,28(11):1848-1850.

[5]陈晓莉，李永吉，王录娜,等.HPLC法定马钱子缓释片中士的宁与马钱子碱[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2013，24(4)：390-393.