槲皮素联合白藜芦醇逆转白血病细胞株HL-60-ADM耐药性的影响

张复华* 尹松梅* 牛国敏 杨国雷 凌奕文 李 蕊 徐嘉愉

（1 南方医科大学附属南海医院，广东 佛山 528200；2 中山大学附属孙逸仙纪念医院，广东 广州 510120）

急性白血病是血液系统最常见的恶性疾病，联合化疗是治疗急性白血病的主要手段，但仍有部分患者不能缓解或缓解后很快复发[1]。白血病细胞对化疗药物产生多药耐药（multidrug resistance，MDR）是化疗失败的主要原因，寻找高效低毒的白血病耐药逆转药物是目前研究的重点[2]。槲皮素是自然界分布最广泛的黄酮类化合物，本研究前期发现槲皮素（Quercetin，Que）通过抑制Cox-2的表达降低Bcl-2的表达，同时诱导Bax的表达，启动Caspase-3级联反应诱导HL-60细胞凋亡[3]。研究提示槲皮素是有效的肿瘤MDR逆转剂，可通过多种机制发挥逆转肿瘤耐药的作用。白藜芦醇（Resveratrol，Res）是从葡萄植物属中提取的多酚类化合物，有抑制肿瘤细胞生长及促凋亡等作用。本研究将Que、Res两种低毒性的植物提取物用于急性髓系白血病耐药细胞株HL-60-A的研究，观察药物单用、联合对肿瘤细胞的生长抑制及逆转耐药等影响，探讨Que及Res逆转白血病细胞耐药的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料：槲皮素（sigma，美国），白藜芦醇（sigma，美国）用DMSO溶解，阿霉素（adriamycin，ADM）（深圳万乐公司，中国）用生理盐水溶解，制成母液后-20 ℃保存。

1.2 细胞培养：HL-60、HL-60-A细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所，HL-60-A为ADM诱导HL-60细胞株建立的耐药细胞株，本实验室冷冻保存。复苏细胞接种于含10%胎牛血清（杭州四季青 中国）、3%谷氨酰胺的RPMI 1640完全培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d传代换液一次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 CCK-8法检测Que、Res的细胞毒性作用：取对数生长期HL-60、HL-60-A细胞，计数并接种于96孔板，每孔接种细胞5×104个。不同浓度Que、Res单用或联用（浓度梯度设为0、12.5、25、50、75、100、150μmol/L）加入细胞中，每个浓度设3个平行孔，设空白孔，阴性对照组，每孔液体终体积200μL，培养48 h后加入37 ℃预热的CCK-8(同仁化学研究所，日本)，在培养箱中继续孵育4 h后在酶标仪上检测，以空白孔调零，检测波长为450 nm，参照波长为630 nm，测定各孔吸光度值，记录结果，取3个复孔的平均吸光度值作为该浓度条件下的OD值。实验重复3次，取平均值。细胞存活率（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%。以药物浓度对数为横轴，抑制率为纵轴绘制浓度-效应曲线，根据线性回归方程求出半数抑制率（IC50）。

1.4 CCK-8法检测Que、Res单用或联用对耐药细胞的逆转作用：取对数生长期HL-60-A细胞接种于96孔板中，分别加入Que、Res与不同浓度ADM（浓度梯度为0 2.5 5 10μg/mL）孵育，实验分组如下：①对照组；②Que 12.5 μmol/L+ADM；③Res 12.5μmol/L+ADM；④Que 6.25μmol/L+ Res 6.25 μmol/L+ADM；⑤Que 25μmol/L+ADM；⑥Res 25μmol/L+ADM；⑦Que 12.5μmol/L+ Res 12.5μmol/L+ADM，余实验步骤同实验方法1.3。耐药指数（Resistance index，RI）=IC50（耐药细胞）/IC50（亲本细胞）；逆转倍数（Reversal fold，RF）=IC50（逆转前）/IC50（逆转后）。

1.5 统计方法：数据描述使用均数±标准差，两独立样本均数的比较用t检验；多组资料间均数的比较用方差分析。数据应用SPSS19.0软件处理。

2 结果

2.1 ADM对HL-60-A细胞耐药性的分析

不同浓度的ADM（浓度梯度为 0.025、0.05、0.1、0.2、1.25、2.5、5、10 μg/mL）与HL-60及HL-60-A共培养48h检测对ADM的耐受性，结果显示，ADM对HL-60及HL-60-A的IC50值分别为（0.042±0.002）、（5.124±0.004）μg/mL，RI为122，提示HL-60-A细胞为耐药细胞株。

2.2 Que、Res单用及联用对HL-60-A细胞毒性的影响

不同浓度的Que、Res分别与HL-60-A共培养48 h检测细胞存活率，Que、Res对HL-60-A的IC50值分别为（74.74±9.27）、（100.57±4.66）μmol/L，提示单独使用Que、Res均可抑制HL-60-A生长，其细胞毒性作用呈剂量依赖性；Que+Res 对HL-60-A的IC50为（54.84±6.29）μmol/L，提示联合使用Que+Res可进一步杀伤白血病细胞（图1）。

图1

2.3 Que、Res单用及联用对HL-60-A细胞耐药性的影响

根据Que、Res对HL-60-A细胞毒性作用可见，Que、Res浓度为12.5及25μmol/L时毒性弱，选用此2种浓度作为逆转耐药浓度分别与ADM孵育。方差分析结果显示，Que 12.5μmol/L、Res 12.5μmol/L、Que 6.25μmol/L+Res 6.25 μmol/L与不同浓度ADM孵育后细胞存活率差别有意义（P＜0.05），Que 25μmol/L、Res 25μmol/L、Que 12.5μmol/L+Res 12.5 μmol/L组间差别亦有意义（P＜0.05）；Que、Res单独使用12.5 μmol/L时ADM的IC50值分别（3.59±0.04）、（3.97±0.02）μg/mL；RF为 1.54倍和1.40倍；剂量25μmol/L时IC50值分别（2.45±0.02）、（3.63±0.01）μg/mL，RF为 2.26倍和1.52倍，提示小剂量Que或Res即可增强ADM对HL-60-A的杀伤作用，Que增敏作用更明显；Que、Res联合使用时IC50值分别（2.98±0.02）、（1.97±0.01）μg/mL，RF为 1.86倍和2.81倍，较Que、Res单用RF明显下降，表明联合使用Que、Res可进一步逆转HL-60-A耐药的作用。

3 讨论

作为黄酮类化合物中最常见及应用范围最广的Que目前认为其有抗氧化、抗过敏、抗血栓、抗血小板聚集和神经保护等多种生物活性及药理作用，且对白血病在内的多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用，逆转肿瘤细胞的多药耐药可能是其发挥抗肿瘤作用的重要机制之一[4,5]。本研究发现Que不仅可以杀伤白血病细胞，对白血病耐药细胞亦有一定的杀伤作用，低剂量时即可以明显增强ADM对HL-60-A的敏感性，与蔡迅等[6]研究结果大致一致。本结果同时提示Que是低毒性物质，单用对HL-60-A的杀伤及逆转耐药效果均有限，可通过联用低毒性药物增强其抗肿瘤作用。Res作为葡萄属提取物是一种安全的药物，亦有一定的抗肿瘤作用[7]，本研究用其联合Que进一步研究抗肿瘤作用。结果发现，Res有一定的抗白血病作用，但较Que弱。低剂量Que+Res（6.25或12.5μmol/L）对HL-60-A的RF明显比单用Que或Res（12.5或25μmol/L）高，提示联合使用Que和Res可提高逆转白血病细胞耐药性，其作用机制可能与其加强抑制细胞膜上MRP泵功能，减少耐药细胞内化疗药物外流有关[8]，本研究将进一步研究其作用机制，为Que、Res应用于临床提供依据。

[1]Gatenby RA,Gillies RJ.Why do cancers have high aerobic glycolysis?[J].Nat Rev Cancer,2004,4 (11): 891-899.

[2]朱丽丹,张江,孔佩艳.白血病耐药及预后相关研究新进展[J].重庆医学,2012,41(2):194-195.

[3]Niu G,Yin S,Xie S.Quercetin induces apoptosis by activating caspase-3 and regulating Bcl-2 and cyclooxygenase-2 pathways in human HL-60 cells[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2011,43(1):30-37.

[4]Nijveldt RJ,van Nood E,van Hoorn DE.Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications[J].Am J Clin Nutr,2001,74(4): 418-425.

[5]Shen J,Zhang W,Wu J.The synergistic reversal effect of multidrug resistance by quercetin and hyperthermia in doxorubicin-resistant human myelogenous leukemia cells[J].Int J Hyperthermia,2008,24(2): 151-159.

[6]蔡讯,陈芳源,韩洁英.槲皮素逆转白血病细胞株HL-60/ADM多药耐药的研究[J].中华肿瘤杂志,2005,27(6):326-329.

[7]赵克森.白藜芦醇的生物学特性和效应[J].中国病理生理杂志,2012,28(9):1709-1711.

[8]Shen J,Zhang W,Wu J.The synergistic reversal effect of multidrug resistance by quercetin and hyperthermia in doxorubicin-resistant human myelogenous leukemia cells[J].Int J Hyperthermia,2008,24(2):151-159.