青霉菌产漆酶的研究及在木质素降解中的应用

卢庆华+邢孟兰+蔡禄

摘要：采用单因素和正交试验对青霉菌产漆酶的优化条件进行研究，并测定了青霉菌对芦苇木质素的降解率。结果表明，最佳培养条件为麦麸17 g/L，酵母膏2 g/L，Al3+ 0.7 g/L，KH2PO4 3 g/L，30 ℃， pH 6.0摇瓶培养192 h，在此条件下漆酶的酶活提高了11.39倍，7 d内该菌能使芦苇木质素降解23.63%。

关键词：青霉菌；漆酶；产酶条件；木质素降解

中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2379-04

Studies on Laccase from Penicillium and Its Application in Lignin Degradation

LU Qing-hua，XING Meng-lan，CAI Lu

（1. Institute of Bioengineering and Technology， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010）

Abstract： The conditions of Penicillium for laccase production were optimized with single factor and orthogonal experiment. The degradation rates of the produced laccase for lignin from reed were determined. The results showed that the activity of laccase increased 11.39 times when Penicillium was cultured 192 h under 30℃ and pH of 6.0 with wheat bran of 17 g/L， yeast extract of 2 g/L， Al3+ of 0.7 g/L， KH2PO4 of 3 g/L. The lignin in reed could be degradated 23.63% in seven days by this Penicillium.

Key words： Penicillium； laccase； fermentation condition； lignin degradation

基金项目：教育部“春晖计划”项目（Z200721201020）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJzy08233）；内蒙古包头市科技攻关项目（2008y100222）

漆酶（Laccase）由日本学者Yoshida[1]于1883年从漆树中分离得到，其是一种很有潜力的含铜的多酚氧化酶，具有强大的催化能力[2-4]，被称为“绿色催化剂”[5]。随着生物造纸技术的日益成熟和研究的深入，漆酶在造纸工业上的研究和应用也逐步深入，漆酶可以选择性的降解木质素，避免损伤纤维素和半纤维素。漆酶的高产菌株为白腐菌，白腐菌对木质素具有很好的降解优势和降解选择性，50 d时木质素的降解率为33.9%～55.4%[6]。吴薇等[7]研究表明黄孢原毛平革菌和变色栓菌Sp1在24 d 时对麦草的木质素降解率达到30%～65%。由于白腐菌特有的降解木质素的功能，在生物制浆、生物漂白、废水处理等的应用都得到了重视[8]。但是，由于菌种产酶较低，降解周期长，很难用于大规模生产。因此，今后研究的主要手段是筛选降解效果好、生长周期短的菌种，并通过对产漆酶菌发酵条件的优化来提高漆酶的活性和产量。

本研究通过单因素和正交试验方法，对筛选的具有较高漆酶产量的青霉菌株进行了培养条件的优化， 同时探索了该漆酶在木质素降解方面的性质。

1材料与方法

1.1菌种

由实验室筛选得到，初步鉴定为青霉菌，命名为QM-001。

1.2培养基

1.2.1基础培养基PDA培养基： 马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然，1×105 Pa灭菌30 min。

1.2.2基础产酶培养基马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然，1×105 Pa灭菌30 min。

1.3方法

1.3.1产酶培养500 mL 的三角瓶装200 mL产酶培养基，接种量为5%， 30 ℃、160 r/min振荡培养，培养过程中观察菌丝生长状况，测定酶活。漆酶活性测定以ABTS为底物，参照Galliano等[9]、Sonia等[10]的方法进行测定。

1.3.2单因素试验①不同碳源对QM-001产漆酶的影响。以蛋白胨为氮源，分别采用等量的不同碳源（乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦麸） 代替葡萄糖， 接种振荡培养，在216 h时，测定其漆酶活力，确定最佳碳源。将得到的最佳碳源分别取15、16、17、18、19、20、21、22 g/L振荡培养，216 h时，测定其产酶情况，得出其最佳浓度。②不同氮源对QM-001产漆酶影响。以麦麸为碳源，分别用等量的牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸铵代替蛋白胨进行培养，在216 h时，测定其酶活，确定最佳氮源。其条件不变，将最佳氮源分别取1、2、3、4、5、6、7 g/L振荡培养，216 h时测定其酶活，找到最佳浓度。③金属离子对产漆酶的影响。在发酵培养基中添加相同浓度的金属离子，170 r/min、30 ℃摇瓶培养7 d，测定不同金属离子对QM-001产漆酶的影响。④初始pH和温度对产酶的影响。分别将基础产酶培养基的初始 pH调至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在170 r/min、30 ℃摇瓶培养216 h，测其酶活。在温度为10、20、30、40、50 ℃的条件下进行发酵产酶试验， 确定最佳发酵温度。

1.3.3正交试验选择麦麸、酵母膏、铝离子和pH 4个因素进行正交试验因素与水平见表1。

1.3.4青霉菌降解芦苇木质素在以上培养基中接入菌种，并加入长为2～3 cm的芦苇，做3个平行，置于恒温振荡器中30 ℃、160 r/min摇瓶培养7 d。以同等体积的蒸馏水和培养基以及另外降解木质素的两种细菌为对照分别浸泡相同质量的芦苇。7 d后分别测定各瓶中芦苇的木质素含量。木质素含量的测定采用GB/T 747-2003纸浆酸不溶木质素的测定，GB/T 7978-2005纸浆酸不溶灰分的测定和GB/T 2677.2-2011造纸原料水分的测定。

2结果与分析

2.1产酶条件优化的结果

2.1.1碳源对产酶的影响由图1可知，当采用麦麸为碳源时，明显较其他碳源所产酶活力高。不同浓度的麦麸对产酶也有较大的影响，麦麸浓度在16g/L 时QM-001产漆酶酶活最大（图2）。

2.1.2不同氮源对QM-001产漆酶影响由图3可知，与有机氮源相比，无机氮源均不利于菌体产酶，可以看出酵母膏的作用最为显著；牛肉膏次之；尿素的效果最差。因此选用酵母膏作为最佳氮源。由图4可知，当酵母膏浓度为3 g/L时，漆酶酶活达到最高。

2.1.3金属离子对产漆酶的影响 由图5可知，Al3+可明显促进其漆酶的增加，而Cu2+、Fe3+、Zn2+也能微弱地促进漆酶的产生，但促进程度依次降低；Mn2+效果不明显，因此确定Al3+为最佳金属离子。当Al3+的浓度达到0.6 g/L时，QM-001产漆酶活力达到最高（图6）。

2.1.4发酵pH和温度对产漆酶的影响如图7 所示，初始 pH 为 6.0 时所产漆酶酶活较高。由图 8可见，当发酵温度为30 ℃时， 所产漆酶活力明显高于其他温度下所产酶活力。

2.1.5正交试验由表2可知，4种因素对漆酶产量影响的主次顺序为D>B>A>C，B、D为影响漆酶产量的主要因素，pH对漆酶产量的影响最大，其次是酵母膏对漆酶产量的影响，可以看出 A3B1C3D2为最优组合，即麦麸最佳浓度为17 g/L，酵母膏最佳浓度为 2 g/L，Al3+最佳浓度为 0.7 g/L，pH为6.0。此时酶活最高，为55.000 U/mL。

2.2优化前后青霉菌产漆酶的比较

用优化后的培养基及培养条件进行发酵产酶，获得产酶曲线， 并与优化前的产酶情况相比较， 结果如图9 所示， 培养基及发酵条件优化后， 青霉菌的产酶量显著提升， 在192 h时有最大酶活， 约59.6 U/mL， 比优化前的最大酶活4.81 U/mL 提高了11.39倍， 最高产酶时间提前了1 d。

2.3与其他菌种降解芦苇木质素的比较

从表3可知，蒸馏水组可近似为芦苇木质素的含量，培养基对芦苇木质素有一定的降解效果，但降解能力很低，只有 1.69%，可视为对木质素降解无影响。青霉菌QM-001浸泡的芦苇木质素含量为25.30，降解率为23.63%。其他2种菌的木质素含量分别为25.73和27.22，都比QM-001要高一些。这说明该菌对纸浆造纸有一定的研究价值，虽然木质素的降解是3种酶共同作用的结果，但是漆酶在其中起了很关键的作用，所以漆酶成了人们研究的重点[11]。

3结论

本研究以提高漆酶产量为目的，对所筛选的青霉菌的产漆酶培养条件进行了优化， 最佳培养条件为： 即麦麸最佳浓度为17 g/L，酵母膏最佳浓度为 2 g/L，Al3+最佳浓度为 0.7g/L，KH2PO43 g/L，160 r/min 摇瓶培养192 h 酶活性达59.6 U/mL， 较优化前提高了11.39倍。在进行生物纸浆的应用时可以在常温下使用，具有低耗能的优点。

同时，本研究对菌种降解芦苇木质素进行了考察，该酶能使芦苇木质素降解23.63%，虽然该菌酶活较低，但是生长温度低，周期较短，对未进行预处理的芦苇能在短时间内降解，说明实验室分离得到的菌种QM-001在生物纸浆过程中具有一定的应用价值，也为本实验室以后对制浆造纸的进一步研究提供依据。

参考文献：

[1] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J]. Chem Soc，1883（43）：472-486.

[2] 刘家扬，蔡宇杰.漆酶高产菌的筛选及产酶优化[J].食品与科技，2010，26（4）：10-14.

[3]刘娜.漆酶改善纤维特性的研究进展[J].中国造纸学报，2008，23（1）：95-100.

[4] 季立才，胡培植.漆酶催化氧化反应研究进展[J].林产化学与工业，1997，17（1）：79-84.

[5] 涂楚桥，梁宏，王光辉.Ag+离子对漆树漆酶催化活性的抑制作用[J].广西科学，1999，6（2）：109-110.

[6] 王宏勋，杜甫佑，张晓昱.白腐菌选择性降解秸秆木质纤维素研究[J].华中科技大学学报，2006，34（3）：97-100.

[7] 吴薇，顿宝庆，姜训鹏，等.高效木质素降解菌的分离筛选[J].食品科技，2008（3）：22-25.

[8] 江凌，韦超海，梁世中.白腐菌降解木质素酶系的特征及其应用[J].化工进展，2007，26（2）：198-202.

[9] GALLIANO H， GAS G， SERIS J L. Lignin degradation by Rigidoporus Lignosus involves synergistic action of two enzyme： MnP and Laccase[J]. Enzyme Microb Technol， 1991， 13：478-482.

[10] SONIA B Y，ZOUHAIER B，SAMI S. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2012，79：41-48.

[11] 徐海娟，梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用原理[J].环境污染治理技术与设备，2000，1（3）：51-54.

（责任编辑程碧军）

1.3.3正交试验选择麦麸、酵母膏、铝离子和pH 4个因素进行正交试验因素与水平见表1。

1.3.4青霉菌降解芦苇木质素在以上培养基中接入菌种，并加入长为2～3 cm的芦苇，做3个平行，置于恒温振荡器中30 ℃、160 r/min摇瓶培养7 d。以同等体积的蒸馏水和培养基以及另外降解木质素的两种细菌为对照分别浸泡相同质量的芦苇。7 d后分别测定各瓶中芦苇的木质素含量。木质素含量的测定采用GB/T 747-2003纸浆酸不溶木质素的测定，GB/T 7978-2005纸浆酸不溶灰分的测定和GB/T 2677.2-2011造纸原料水分的测定。

2结果与分析

2.1产酶条件优化的结果

2.1.1碳源对产酶的影响由图1可知，当采用麦麸为碳源时，明显较其他碳源所产酶活力高。不同浓度的麦麸对产酶也有较大的影响，麦麸浓度在16g/L 时QM-001产漆酶酶活最大（图2）。

2.1.2不同氮源对QM-001产漆酶影响由图3可知，与有机氮源相比，无机氮源均不利于菌体产酶，可以看出酵母膏的作用最为显著；牛肉膏次之；尿素的效果最差。因此选用酵母膏作为最佳氮源。由图4可知，当酵母膏浓度为3 g/L时，漆酶酶活达到最高。

2.1.3金属离子对产漆酶的影响 由图5可知，Al3+可明显促进其漆酶的增加，而Cu2+、Fe3+、Zn2+也能微弱地促进漆酶的产生，但促进程度依次降低；Mn2+效果不明显，因此确定Al3+为最佳金属离子。当Al3+的浓度达到0.6 g/L时，QM-001产漆酶活力达到最高（图6）。

2.1.4发酵pH和温度对产漆酶的影响如图7 所示，初始 pH 为 6.0 时所产漆酶酶活较高。由图 8可见，当发酵温度为30 ℃时， 所产漆酶活力明显高于其他温度下所产酶活力。

2.1.5正交试验由表2可知，4种因素对漆酶产量影响的主次顺序为D>B>A>C，B、D为影响漆酶产量的主要因素，pH对漆酶产量的影响最大，其次是酵母膏对漆酶产量的影响，可以看出 A3B1C3D2为最优组合，即麦麸最佳浓度为17 g/L，酵母膏最佳浓度为 2 g/L，Al3+最佳浓度为 0.7 g/L，pH为6.0。此时酶活最高，为55.000 U/mL。

2.2优化前后青霉菌产漆酶的比较

用优化后的培养基及培养条件进行发酵产酶，获得产酶曲线， 并与优化前的产酶情况相比较， 结果如图9 所示， 培养基及发酵条件优化后， 青霉菌的产酶量显著提升， 在192 h时有最大酶活， 约59.6 U/mL， 比优化前的最大酶活4.81 U/mL 提高了11.39倍， 最高产酶时间提前了1 d。

2.3与其他菌种降解芦苇木质素的比较

从表3可知，蒸馏水组可近似为芦苇木质素的含量，培养基对芦苇木质素有一定的降解效果，但降解能力很低，只有 1.69%，可视为对木质素降解无影响。青霉菌QM-001浸泡的芦苇木质素含量为25.30，降解率为23.63%。其他2种菌的木质素含量分别为25.73和27.22，都比QM-001要高一些。这说明该菌对纸浆造纸有一定的研究价值，虽然木质素的降解是3种酶共同作用的结果，但是漆酶在其中起了很关键的作用，所以漆酶成了人们研究的重点[11]。

3结论

本研究以提高漆酶产量为目的，对所筛选的青霉菌的产漆酶培养条件进行了优化， 最佳培养条件为： 即麦麸最佳浓度为17 g/L，酵母膏最佳浓度为 2 g/L，Al3+最佳浓度为 0.7g/L，KH2PO43 g/L，160 r/min 摇瓶培养192 h 酶活性达59.6 U/mL， 较优化前提高了11.39倍。在进行生物纸浆的应用时可以在常温下使用，具有低耗能的优点。

同时，本研究对菌种降解芦苇木质素进行了考察，该酶能使芦苇木质素降解23.63%，虽然该菌酶活较低，但是生长温度低，周期较短，对未进行预处理的芦苇能在短时间内降解，说明实验室分离得到的菌种QM-001在生物纸浆过程中具有一定的应用价值，也为本实验室以后对制浆造纸的进一步研究提供依据。

参考文献：

[1] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J]. Chem Soc，1883（43）：472-486.

[2] 刘家扬，蔡宇杰.漆酶高产菌的筛选及产酶优化[J].食品与科技，2010，26（4）：10-14.

[3]刘娜.漆酶改善纤维特性的研究进展[J].中国造纸学报，2008，23（1）：95-100.

[4] 季立才，胡培植.漆酶催化氧化反应研究进展[J].林产化学与工业，1997，17（1）：79-84.

[5] 涂楚桥，梁宏，王光辉.Ag+离子对漆树漆酶催化活性的抑制作用[J].广西科学，1999，6（2）：109-110.

[6] 王宏勋，杜甫佑，张晓昱.白腐菌选择性降解秸秆木质纤维素研究[J].华中科技大学学报，2006，34（3）：97-100.

[7] 吴薇，顿宝庆，姜训鹏，等.高效木质素降解菌的分离筛选[J].食品科技，2008（3）：22-25.

[8] 江凌，韦超海，梁世中.白腐菌降解木质素酶系的特征及其应用[J].化工进展，2007，26（2）：198-202.

[9] GALLIANO H， GAS G， SERIS J L. Lignin degradation by Rigidoporus Lignosus involves synergistic action of two enzyme： MnP and Laccase[J]. Enzyme Microb Technol， 1991， 13：478-482.

[10] SONIA B Y，ZOUHAIER B，SAMI S. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2012，79：41-48.

[11] 徐海娟，梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用原理[J].环境污染治理技术与设备，2000，1（3）：51-54.

（责任编辑程碧军）

1.3.3正交试验选择麦麸、酵母膏、铝离子和pH 4个因素进行正交试验因素与水平见表1。

1.3.4青霉菌降解芦苇木质素在以上培养基中接入菌种，并加入长为2～3 cm的芦苇，做3个平行，置于恒温振荡器中30 ℃、160 r/min摇瓶培养7 d。以同等体积的蒸馏水和培养基以及另外降解木质素的两种细菌为对照分别浸泡相同质量的芦苇。7 d后分别测定各瓶中芦苇的木质素含量。木质素含量的测定采用GB/T 747-2003纸浆酸不溶木质素的测定，GB/T 7978-2005纸浆酸不溶灰分的测定和GB/T 2677.2-2011造纸原料水分的测定。

2结果与分析

2.1产酶条件优化的结果

2.1.1碳源对产酶的影响由图1可知，当采用麦麸为碳源时，明显较其他碳源所产酶活力高。不同浓度的麦麸对产酶也有较大的影响，麦麸浓度在16g/L 时QM-001产漆酶酶活最大（图2）。

2.1.2不同氮源对QM-001产漆酶影响由图3可知，与有机氮源相比，无机氮源均不利于菌体产酶，可以看出酵母膏的作用最为显著；牛肉膏次之；尿素的效果最差。因此选用酵母膏作为最佳氮源。由图4可知，当酵母膏浓度为3 g/L时，漆酶酶活达到最高。

2.1.3金属离子对产漆酶的影响 由图5可知，Al3+可明显促进其漆酶的增加，而Cu2+、Fe3+、Zn2+也能微弱地促进漆酶的产生，但促进程度依次降低；Mn2+效果不明显，因此确定Al3+为最佳金属离子。当Al3+的浓度达到0.6 g/L时，QM-001产漆酶活力达到最高（图6）。

2.1.4发酵pH和温度对产漆酶的影响如图7 所示，初始 pH 为 6.0 时所产漆酶酶活较高。由图 8可见，当发酵温度为30 ℃时， 所产漆酶活力明显高于其他温度下所产酶活力。

2.1.5正交试验由表2可知，4种因素对漆酶产量影响的主次顺序为D>B>A>C，B、D为影响漆酶产量的主要因素，pH对漆酶产量的影响最大，其次是酵母膏对漆酶产量的影响，可以看出 A3B1C3D2为最优组合，即麦麸最佳浓度为17 g/L，酵母膏最佳浓度为 2 g/L，Al3+最佳浓度为 0.7 g/L，pH为6.0。此时酶活最高，为55.000 U/mL。

2.2优化前后青霉菌产漆酶的比较

用优化后的培养基及培养条件进行发酵产酶，获得产酶曲线， 并与优化前的产酶情况相比较， 结果如图9 所示， 培养基及发酵条件优化后， 青霉菌的产酶量显著提升， 在192 h时有最大酶活， 约59.6 U/mL， 比优化前的最大酶活4.81 U/mL 提高了11.39倍， 最高产酶时间提前了1 d。

2.3与其他菌种降解芦苇木质素的比较

从表3可知，蒸馏水组可近似为芦苇木质素的含量，培养基对芦苇木质素有一定的降解效果，但降解能力很低，只有 1.69%，可视为对木质素降解无影响。青霉菌QM-001浸泡的芦苇木质素含量为25.30，降解率为23.63%。其他2种菌的木质素含量分别为25.73和27.22，都比QM-001要高一些。这说明该菌对纸浆造纸有一定的研究价值，虽然木质素的降解是3种酶共同作用的结果，但是漆酶在其中起了很关键的作用，所以漆酶成了人们研究的重点[11]。

3结论

本研究以提高漆酶产量为目的，对所筛选的青霉菌的产漆酶培养条件进行了优化， 最佳培养条件为： 即麦麸最佳浓度为17 g/L，酵母膏最佳浓度为 2 g/L，Al3+最佳浓度为 0.7g/L，KH2PO43 g/L，160 r/min 摇瓶培养192 h 酶活性达59.6 U/mL， 较优化前提高了11.39倍。在进行生物纸浆的应用时可以在常温下使用，具有低耗能的优点。

同时，本研究对菌种降解芦苇木质素进行了考察，该酶能使芦苇木质素降解23.63%，虽然该菌酶活较低，但是生长温度低，周期较短，对未进行预处理的芦苇能在短时间内降解，说明实验室分离得到的菌种QM-001在生物纸浆过程中具有一定的应用价值，也为本实验室以后对制浆造纸的进一步研究提供依据。

参考文献：

[1] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J]. Chem Soc，1883（43）：472-486.

[2] 刘家扬，蔡宇杰.漆酶高产菌的筛选及产酶优化[J].食品与科技，2010，26（4）：10-14.

[3]刘娜.漆酶改善纤维特性的研究进展[J].中国造纸学报，2008，23（1）：95-100.

[4] 季立才，胡培植.漆酶催化氧化反应研究进展[J].林产化学与工业，1997，17（1）：79-84.

[5] 涂楚桥，梁宏，王光辉.Ag+离子对漆树漆酶催化活性的抑制作用[J].广西科学，1999，6（2）：109-110.

[6] 王宏勋，杜甫佑，张晓昱.白腐菌选择性降解秸秆木质纤维素研究[J].华中科技大学学报，2006，34（3）：97-100.

[7] 吴薇，顿宝庆，姜训鹏，等.高效木质素降解菌的分离筛选[J].食品科技，2008（3）：22-25.

[8] 江凌，韦超海，梁世中.白腐菌降解木质素酶系的特征及其应用[J].化工进展，2007，26（2）：198-202.

[9] GALLIANO H， GAS G， SERIS J L. Lignin degradation by Rigidoporus Lignosus involves synergistic action of two enzyme： MnP and Laccase[J]. Enzyme Microb Technol， 1991， 13：478-482.

[10] SONIA B Y，ZOUHAIER B，SAMI S. Catalytic behavior and detoxifying ability of an atypical homotrimeric laccase from the thermophilic strain Scytalidium thermophilum on selected azo and triarylmethane dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2012，79：41-48.

[11] 徐海娟，梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用原理[J].环境污染治理技术与设备，2000，1（3）：51-54.

（责任编辑程碧军）