提高LIPOFECTAMINE2000对PC12细胞转染效率的研究

邱 烨

浙江省湖州市南浔区中西医结合医院检验科，浙江湖州 313009

PC12细胞诱导产生的神经轴突能作为研究神经退行性疾病及脊柱损伤的研究模型[1-2]，也是研究神经内分泌试验的模型[3]。细胞转染技术是分子生物学及基因工程关键步骤之一[4]，也是体外研究神经细胞特定基因表达调控及遗传病基因治疗的重要技术之一[5]，但常用的阳离子脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率低[1，6-8]。 本研究参照相关文献[8-10]，通过在阳离子脂质体转染过程中加入氯喹及亚精胺，同时调整阳离子脂质体转染试剂与DNA用量的比例和转染时间，实现提高PC12细胞转染率，且未影响细胞的正常功能，为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：PC12 细胞（American Culture Collection），RPMI1640 培养基 （Sigma 公司），Lipofectamine2000（Invitrogen 公司），FuGENE HD （Roche 公司），PolyJet（Signagen Laboratoies 公 司 ），Lipofectamine LTX and Plus（Invitrogen 公司），pEGFP-N1（BD Biosciences 公司），氯喹（Sigma 公司），亚精胺（Sigma 公司），Ⅰ型牛胶原蛋白 （BD Biosciences公司），神经生长因子（NGF）（Peprotech 公司），噻唑蓝（MTT）（Sigma 公司）。Axiovert 100 M倒置荧光显微镜 （Carl Zeiss公司），MetaMorph图像分析处理软件 （Molecular Devices公司），EL808 酶标仪（Bio-Tek Instrument公司）。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞培养 PC12细胞培养参照相关文献[11-12]，细胞密度至 70%左右时进行传代，传至 2～3代的PC12细胞备用。

1.2.2 PC12细胞转染 PC12细胞培养参照文献[11]的方法，转染的基本步骤[8]：将 4 μL Lipofectamine2000转染试剂加入75 μL不含血清的新鲜RPMI 1640培养基中混匀，同时将1 μg质粒 pEGFP-N1加入150 μL不含血清的新鲜RPMI 1640培养基中孵育5 min后将两溶液混匀，室温静置30 min，另将含（或不含）36 mmol/L氯喹、32 μmol/L亚精胺的无血清 RPMI 1640培养基75 μL加入上述阳离子脂质体/DNA复合物，移去细胞培养液后加入以上阳离子脂质体/DNA复合物，培养4 h后再弃去上述含阳离子脂质体/DNA复合物的细胞培养液，换成新鲜含5%胎牛血清、10%小牛血清的 RPMI 1640培养基，每室 300 μL。……