中华水韭耐重金属胁迫基因的分离

曹思源+王芳+丁国华+李佳琦+高歌+安梦妍

摘 要：以中华水韭为试验材料，用200μmol·L-1的氯化镉溶液和2g·L-1的硝酸铅分别对其进行胁迫处理，采用cDNA-AFLP技术分离差异表达基因，通过Blast（The Basic Local Alignment Search Tool）同源性比对分析基因功能，为寻找耐重金属胁迫相关基因和揭示水韭对环境变化响应的分子机理奠定基础。试验结果如下：共有15条差异条带被成功克隆和测序，其中13条差异片段可以在数据库找到与之同源的序列。镉胁迫差异表达TDF9与ABC型（ATP-binding cassette）转运蛋白C亚族基因有84%同源性。铅胁迫差异表达TDF4和TDF7与环形锌指蛋白（RING Zinc Finger Protein）有75%同源性。这些基因的发现为揭示水韭对环境变化敏感的分子机理奠定基础。

关键词：中华水韭；重金属胁迫；铅；镉；cDNA-AFLP

中图分类号 Q948.116 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）18-22-03

当前土壤和水域的重金属污染日益严重，为此国家于2013年启动了重金属污染耕地修复的试点[1]。重金属（主要是镉、铅、砷、汞、铬等）不仅严重影响植物的生长发育，而且通过粮食及蔬菜进入人体并积累，威胁人类身体健康。其中镉和铅毒性最强，污染也最严重[2]。

中华水韭（Isoetes sinensis Palmer），小型叶蕨类，为水韭科水韭属（孑遗属）沼泽指示植物，因生存环境的变迁和生存区域的减少，已成为濒危物种，被列为国家一级重点保护野生植物[3]。对中华水韭生境调查发现，土壤中镉和铅的含量严重超标[4]。研究表明，中华水韭对除草剂[5]和重金属铅有很高的耐受性，因此，研究“植物活化石”中华水韭对重金属胁迫的响应，特别是在基因表达方面的响应，对于揭示中华水韭对重金属胁迫响应的分子机制及植物响应逆境的原始反应机制有着重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料 试材中华水韭为我院蕨类研究室繁殖培养的植株。于2011年4月选取长势整齐一致的中华水韭植株，用水冲洗去除根部泥土，毎3株为一组放入装有蒸馏水的容器中重新培养至长出新根。待根生长至3cm长时，倒掉蒸馏水，添加等体积的Hoagland完全营养液，每7d更换一次营养液，约30d后植株恢复长势进行重金属胁迫处理。

1.2 重金属胁迫处理 处理前倒掉营养液，加等量去离子水。2d后倒掉去离子水，对照组仍加去离子水，处理组分别加等量200μmol·L-1的氯化镉溶液和2g·L-1的硝酸铅。自胁迫处理开始，分别于第6h、24h、72h煎取中部长势良好叶片迅速放到液氮中冷冻，并保存在-80℃冰箱中，用于RNA提取。

1.3 cDNA-AFLP分析 RNA提取采用天根生化试剂（北京）有限公司的植物总RNA提取试剂盒，双链cDNA的合成采用宝生物公司的cDNA Synthesis Kit（M-MLV Version）试剂盒，紫外分光光度计测定双链cDNA浓度，并调整各样品浓度为80ng·μL-1。AFLP流程及反应体系参照黄河等[6]的方法进行，具体操作如下：（1）酶切：用EcoR I和Mse I对反转录合成的cDNA进行双酶切。（2）连接：将EcoR I-adaptor、Mse I-adaptor接头用T4 DNA Ligase连接。（3）预扩增：用EcoR I-00和Mse I-00为引物进行预扩增。（4）选择性扩增：通用引物（E1～8，M1～8，共64个引物组合）进行选择性扩增。（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.4 差异表达片段的回收、克隆、测序及同源性分析 将聚丙烯酰胺凝胶上差异条带用灭菌的锋利刀片切下，煮沸法回收DNA，以回收产物为模板，用对应的引物组合重新进行PCR扩增。扩增体系和反应条件跟预扩增体系相同。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并送上海生工生物工程公司测序。测序结果提交NCBI进行Blastx同源性比对。

2 结果与分析

2.1 差异表达条带的统计和分类 根据镉和铅胁迫的cDNA-AFLP电泳图将差异表达条带进行统计并分类，大致分成4类：（1）I类型条带：条带在正常情况和整个重金属胁迫的过程都存在。基因的表达水平在正常情况和整个重金属胁迫的过程中没有任何改变。（2）II类型条带：在正常情况和重金属胁迫初期存在，随着重金属胁迫强度的加大，基因的表达量减弱或消失随后又增强。（3）III类型条带：在正常情况下没有或表达很弱，在重金属胁迫的过程中开始表达或表达量加强。（4）IV类型条带：在正常情况下存在，在重金属胁迫过程中条带消失，不再表达。

将铅和镉胁迫的差异条带进行统计，总共统计出184条差异表达TDFs。其中，I类型差异表达TDFs为24条，占总数的13%；II类型差异表达TDFs为24条，占总数的13%；III类型差异表达TDFs为109条，占总数的59%；IV类型差异表达TDFs为27条，占总数的15%。

2.2 差异表达条带的测序和同源性分析 铅胁迫和镉胁迫的聚丙酰胺凝胶中共挑选出15条差异条带进行回收，条带都可以被选择性扩增引物重新扩增，这些条带分布主要在500～250bp范围内。将回收的15条差异片段TDFs进行测序，测序后的差异条带与纯化后的片段长度一致，试验中所用的接头序列与测序片段两端序列一致，表明序列测定结果可靠。将15条差异条带测序结果用NCBI中的Blastn和Blastx进行同源序列的比对，其同源性比对结果见表1。

表1 差异表达基因片段在NCBI进行的Blast比对

[TDFs＼&Size（bp）＼&Sequence similarity＼&E value＼&TDF1＼&604＼&Hypothetical protein SELMODRAFT_177510＼&a9e-66＼&TDF2＼&402＼&Triticum aestivum cDNA，clone： WT003_G01，cultivar： Chinese Spring＼&1e-70＼&TDF3＼&316＼&No match＼&＼&TDF4＼&274＼&V-type proton ATPase subunit G-like isoform 1＼&a2e-09＼&zinc finger RING-type protein＼&a9e-09＼&TDF5＼&131＼&No match＼&＼&TDF6＼&168＼&Isoetes engelmannii 18S ribosomal RNA gene，partial sequence＼&4e-47＼&TDF7＼&205＼&PREDICTED： V-type proton ATPase subunit G-like isoform 1 [Cucumis sativus]＼&a7e-10＼&zinc finger RING-type protein [Cucumis sativus]＼&a3e-09＼&TDF8 ＼&177＼&hypothetical protein [Pseudomonas sp.PAMC 26793]＼&a1e-12＼&TDF9＼&398＼&Medicago truncatula ABC transporter C family member （MTR_8g040620） mRNA，complete cds＼&7e-34＼&TDF10＼&373＼&No match＼&＼&TDF11＼&285＼&ABC transporter B family protein＼&a2.0＼&putative 4-alpha-glucanotransferase [Prevotella disiens]＼&a7.1＼&TDF12＼&371＼&pentatricopeptide repeat-containing protein At1g11290-like [Vitis vinifera]＼&a3e-23＼&TDF13endprint

＼&80＼&retrotransposon protein，putative，unclassified [Oryza sativa Japonica Group]＼&a2.8＼&TDF14＼&410＼&RecName：Full=Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein； AltName： Full=ORF 2＼&9e-05＼& retrotransposon protein，putative，unclassified [Oryza sativa Japonica Group]＼&a1e-07＼&putative non-LTR retroelement reverse transcriptase [Oryza sativa Japonica Group]＼&a1e-07＼&TDF15 ＼&336＼&Predicted RNA-binding protein homologous to eukaryotic snRNP [Ruminococcus obeum A2-162]＼&a3.6＼&]

注：a表示进行blastx比对得到的，其余是进行blastn比对得到的；TDF1-8为铅胁迫差异表达基因，TDF 9-15为镉胁迫差异表达基因。

在测序成功的差异片段中，通过blastx同源性比对，铅胁迫的TDF4和TDF7与V型ATP酶G亚基和环形锌指蛋白有均75%的同源性。镉胁迫的TDF11与ABC型转运蛋白家族B亚族和假定的4-α葡聚糖有同源性。镉胁迫的TDF12与三角状五肽重复蛋白有同源性。镉胁迫的TDF14与反转录转座子的蛋白质有同源性。通过blastn同源性比对，铅胁迫的TDF6基因与水韭的18S核糖体部RNA基因有100%的同源性。镉胁迫的TDF9基因与ABC型转运蛋白家族中C亚族的基因有84%的同源性。

3 结论与讨论

本文分离得到的TDF4、TDF7、TDF9均比对出同源性在75%以上的基因，这些基因与重金属胁迫相关。其中，镉胁迫的TDF9与ABC型转运蛋白家族C亚族基因有84%同源性。从cDNA-AFLP电泳图观察，属第Ⅲ类型条带。该基因在镉胁迫之前没有出现，在镉胁迫以后开始表达。ABC型转运蛋白（ATP-binding cassette transporters），全称为腺苷三磷酸结合盒转运蛋白，是一种跨膜转运器，在其上含有与ATP结合的框架，通过与ATP的解离和结合来调节物质的跨膜运输[7]。ABC型转运蛋白大部分分布在真核细胞的细胞膜上，少部分分布在线粒体、过氧化物、液泡膜、内质网上。ABC型转运蛋白在植物的生命活动有重要的作用，一是将细胞内外的异源性化合物和有毒物质进行隔离或排出细胞外；二是将植物的次生代谢产物转运到细胞质中或区室化；三是转运植物生长发育中所需要的信号分子。ABC型转运蛋白家族C亚族（ABCC）是ABC转运蛋白家族中的一个，是ABC型转运蛋白加上了一个疏水性N端，一般相关报道是以MRP（multidrug resistance-associated protein）命名[8]。MRP亚族全称为广谱抗药性相关蛋白亚家族，主要存在液泡膜上，在细胞质膜上也有存在，其主要功能是将有毒物质转运到液泡中，并将有毒物质进行螯合，起到对细胞的解毒作用。有研究证明，MRP对受重金属镉胁迫的植株有解毒作用[9]。MRP可以充当镉泵，参与跨液泡膜转运Cd2+螯合物或GS-Cd复合体[10]。有研究表明，大麦在受到200μM镉胁迫下，有一个与AtMRP3具有同源性的基因上调表达[11]。还有研究发现，烟草在受到镉胁迫的过程中，液泡膜上的AtMRP7基因过量表达，产生的MRP转运蛋白将镉转运到叶片的液泡中，提高液泡中镉的含量，从而降低镉对植物的毒害[12]。TDF9就是镉胁迫所产生差异表达的基因，而且是在镉胁迫后开始表达的，通过以上研究者的研究，可以推测中华水韭在受到镉胁迫时，产生了对镉响应的基因TDF9，其表达产物的作用是否与MRP一致，还需进一步的试验加以验证。

铅胁迫的TDF4和TDF7与环形锌指蛋白（Ring Zinc Finger Protein）有75%同源性。从cDNA-AFLP电泳图观察，也属于第Ⅲ类型的条带。该基因在铅胁迫之前没有出现，在铅胁迫以后开始表达。环形锌指蛋白是一个具有泛素连接酶作用的结构，又叫E3泛素连接酶[13]。它与泛素激活酶E1、泛素结合酶E2共同作用，将泛素分子标记的靶蛋白进行特异性修饰。这一作用机理可以对细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、DNA损伤修等生命活动起到调控。最新研究表明：拟南芥环形锌指蛋白LsRZF1基因可以降低脱落酸的含量及渗透胁迫，并能控制脯氨酸的代谢，从而增强植物对逆境环境的适应[14]。

目前在国际上，对中华水韭的生理生化过程及形态发育研究已取得较多成果，但分子机理方面的研究成果较少。以上这些差异表达基因的发现将为揭示中华水韭对环境变化敏感的分子机理奠定基础。

参考文献

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（责编：张宏民）endprint