吸光度法快速确定菌悬液浓度及其适用范围

马秀玲，陈蕊君，王 飞，徐腾月

(中国人民解放军总后勤部 军需装备研究所，北京 100010)

微生物生长中细胞数量的测定主要有直接计数法(测定时需用细菌计数器或血球计数板，本法仅适于单细胞的微生物类群)、比浊法、稀释平板计数法、液体稀释培养计数法、浓缩法。在一定的浓度范围内，菌悬液中的微生物细胞浓度与液体的光密度(OD值)成正比，与透光度成反比，因此可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌悬液的浓度。由于细胞浓度仅在一定范围内与光密度呈线性关系，因此，待测菌悬液的浓度不宜过高或过低，过高会超过仪器的测量范围并且细胞浓度与光密度不呈线性关系，同时要求培养液的颜色不宜过深，并尽量减少颗粒性杂质的数量。该方法的优点是快捷简便，容易操作;缺点与麦氏比浊法相同，即难以区分活细胞与死细胞以及与微生物类似的杂质。另外，形状不规则的某些霉菌、放线菌，因菌悬液浓度并不能代表细胞数量，所以OD值和菌悬液浓度不成正比关系［1］。本实验以大肠埃希菌为例，先用比浊法制成一定浓度的菌悬液，稀释后得到不同稀释度的菌悬液，再通过分光光度计测定不同浓度菌悬液的吸光度值，从而得到在某一浓度范围内菌悬液浓度与吸光度值的线性关系，同时应用稀释平板法对菌落总数进行了验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及试剂 大肠埃希菌(Escherichia coli，ATCC 25922)购于北京陆桥技术有限责任公司;平板计数培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购于北京陆桥技术有限责任公司，均121℃高压灭菌15 min后备用。

1.1.2 仪器 UV-2450紫外可见分光光度计(日本日立公司);LHZ-111落地式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司);BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司);LRH-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

1.2 方法

按照麦氏比浊法配制8×108cfu/g的菌悬液，再将其逐级稀释至100 cfu/g，每个稀释度在测定吸光度的同时用平板计数法测定其菌落总数。

1.2.1 待测菌液的制备 取1环在石蜡中保存的菌种以划线法接种到平板计数培养基平板上，(36±1)℃培养18～24 h。取TSB培养基100 mL放入锥形瓶中，用接种环挑取上述平皿上的典型菌落接种在TSB锥形瓶内培养。培养条件为(36 ±1)℃、18 ～24 h，振动频率 110 r/min［2］。

1.2.2 麦氏比浊法预估菌悬液浓度 配制稀释液:取TSB培养基25 mL放入500 mL三角瓶中，再加475 mL无菌水混匀备用。无菌操作将被测定的TSB培养物加到与标准管相同直径的无菌试管中［3］。以无菌操作向被测定试管加入稀释液，然后在白纸上划平行直线，直接用肉眼观察(利用光在不同浓度液体中的折射不同)，直到浊度与所要求的标准管的浊度相同。

1.2.3 标准曲线的制作 制备好的菌悬液浓度大约为8×108cfu/g，取0.5 mL稀释制备成4×108cfu/g菌悬液。以同样的方式依次稀释，直到稀释至100 cfu/g，用UV-2450紫外可见分光光度计在波长600 nm［4］下，测量不同菌悬液的吸光度值。

1.2.4 菌落总数的测定 在无菌条件下，用1 mL移液管吸取不同稀释度的菌悬液至无菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，同时分别吸取1 mL空白稀释液加入2个无菌平皿内做空白对照。及时用15～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于(46±1)℃恒温水浴保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，(36±1)℃培养24 h［5］。计数各平皿的菌落总数。

2 结果与分析

2.1 菌落总数结果

测得的菌悬液平板计数结果及所对应的吸光度值见表1。

表1 不同浓度菌悬液的平板计数结果及所对应的吸光度值Table 1 The count results of bacterial suspension plate of different concentration and the corresponding absorbance values

由表1可见，菌悬液稀释倍数较高时，吸光度值几乎为零，直到平板菌落总数达到6×104cfu/g时，其对应菌悬液的吸光度值才开始出现明显的变化。

2.2 标准曲线的绘制

用 6.0 ×104、1.2 ×105、6.0 × 105、1.2 × 106、6.0 ×106、1.2 ×107cfu/g 六个菌落总数的计数结果为横坐标，用对应的菌悬液测定的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，相关系数能达到0.9952。

图1 菌落总数和吸光度值关系的标准曲线Fig.1 The standard curve between total numbers of colony and absorbance values

3 讨论

试验结果显示，当菌落总数在63～1.2×104cfu/g之间时，菌悬液吸光度值变化很小;当菌落总数大于6×104cfu/g时，吸光度值变化明显，因此利用分光光度计测定吸光度值确定菌悬液浓度方法不适用于菌落总数在105cfu/g以下的菌悬液。当菌落总数≥6×104cfu/g时，吸光度值与菌落总数呈强相关，R2=0.9952，因此用吸光度法确定菌悬液浓度时，宜在105～108cfu/g之间。

实验中由麦氏比浊法预估的菌悬液浓度为8×108cfu/g，但实际测定的浓度为1.2×107cfu/g。原因是麦氏比浊法用肉眼直接观察，并且培养基颜色偏黄，与标准管颜色不一致，所测菌悬液浓度与实际浓度之间有偏差。本实验用吸光度法确定菌悬液浓度，并用平板计数法进行了验证，方法更科学、更简便。

［1］官小红，杨俊，王庭欣，等.食品微生物学检验［M］.北京:中国计量出版社，2005:87-88.

［2］朱艳静，李宇.测定菌体浓度的简便方法［J］.工业微生物，2006，36(4):47-49.

［3］李瑾，刘振，何艳玲.微生物干粉培养基质控图解手册［M］.北京:科学技术出版社，2007:3-5.

［4］熊海燕，王为国，王存文，等.介绍测量菌液浓度的一种方法［J］.四川食品与发酵，2003，(4):45-46.

［5］GB 4789.2-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定［S］.