人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能

王雪莲，葛安兴，腾秀志

(1.中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110001;2.辽宁电力中心医院，辽宁 沈阳 110003)

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是最常见的生殖道感染病毒，与尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌等疾病密切相关［1-2］。研究证实，MHC-I限制性、HPV特异性的CTL能够识别、杀伤病毒感染细胞及病毒转化的肿瘤细胞，在HPV感染的清除、宫颈上皮内瘤变的消退及HPV相关肿瘤的控制过程中发挥至关重要的作用［3-4］。而MHC-II限制性、抗原特异性的CD4+T细胞通过将活化信号传递给专职的抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)［5］，在 CTL 的效应阶段提供CTL生长刺激信号［6］，进而启动和维持免疫反应。因为HPV感染只限于局部皮肤，无系统感染相，因而外周循环中HPV特异性T细胞的数量少。为了研究HPV感染人群的抗原特异性的免疫反应，应用HPV抗原体外刺激扩增CD8+T细胞、CD4+T细胞，获得相应的T细胞系。在科研过程及临床的免疫治疗过程中，经常需要将分离的T细胞或获得的T细胞系进行冻存。为了研究细胞冻存后HPV特异性的T细胞系细胞存活率及功能，应用包含10%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、90%小牛血清的冻存液冻存6个T细胞系细胞，液氮中冻存不同时间后复苏，台盼蓝(trypan blue)染色法检测复苏后T细胞系细胞的存活率，ELISPOT检测复苏后T细胞系细胞的功能，以利于更好地鉴定建系的细胞系及其推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料

二甲基亚砜、小牛血清、台盼蓝、RPMI-1640培养基购自Fisher公司;细胞冻存盒购自美国Thermo Scientific公司;植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)购自美国 Sigma公司;ELISPOT板购自美国Millipore公司;IFN-γ单克隆抗体和生物素标记的 Anti-IFN-γ单克隆抗体购自瑞典Mabtech公司;抗生物素蛋白结合的生物素化辣根过氧化物酶购自Vector Laboratories公司;ELISPOT分析仪为美国Cell Technology公司产品。

1.2 方法

1.2.1 T细胞系细胞的冻存和复苏 前期实验建立了6个HPV特异性T细胞系(5个CD4 T细胞系和1个CD8 T细胞系)［7-8］，6个 T细胞系建立后应用台盼蓝染色，计数细胞，测定细胞活力。T细胞系细胞离心后重悬于预冷的小牛血清中，混匀后逐滴加入等体积的预冷液体(20%二甲基亚砜和80%小牛血清)，使其细胞浓度为5×107/mL。将细胞转移至预冷的冻存管中，每管细胞数不超过5×107，将细胞冻存管置于冻存盒中，－70℃冰箱中过夜，次日将细胞冻存管转移至液氮中保存。复苏时将细胞冻存管自液氮中取出后置于37℃水浴箱中，晃动冻存管，在接近全部溶解时，将细胞移至离心管，RPMI1640-10F洗涤2次后，用细胞培养液悬浮细胞，台盼蓝染色后计数细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，37℃培养箱中过夜培养，次日再次计数细胞后用于ELISPOT实验。

细胞存活率=(解冻时细胞数或过夜培养后细胞数/冻存前细胞数)×100%。

1.2.2 ELISPOT检测复苏的T细胞系细胞的功能 应用ELISPOT方法，以T细胞多克隆刺激剂PHA为抗原，检测复苏后的6个T细胞系细胞产生IFN-γ的能力，同时设置阴性对照。ELISPOT步骤参考文献［9］。IFN-γ 单克隆抗体(5 μg/mL)包被ELISPOT板，4℃过夜。次日PBS洗4次。用含5%人血清的RPMI 1640培养基(RP-5H;50 μL/孔)37 ℃封闭2 h。每孔加入100 μL T细胞系细胞(1 × 105/孔)，50 μL PHA(10 μmol/L)，阴性对照孔中加入RP-5H代替PHA。每一条件设3个平行孔。平板置37℃细胞培养箱中过夜。次日，PBS洗4次后，加入生物素标记的Anti-IFN-γ 单克隆抗体(1 μg/mL)，37 ℃ 孵育 2 h。PBS洗4次后，加入抗生物素蛋白结合的生物素化辣根过氧化物酶，37℃孵育1 h。PBS洗4次后，加底物二氨基苯(diaminobenzene)显色。去离子水终止显色。ELISPOT分析仪计数斑点数量。

2 结果与分析

2.1 细胞计数

表1 细胞冻存前后、过夜培养后的细胞数量及细胞存活率Table 1 The number and recovery rate of T cell line cells before and after cryopreservation and after overnight incubation

6个T细胞系冻存不同时间(32～54个月)后复苏，冻存前后及过夜培养后细胞数量见表1，分别计算解冻时及过夜培养后的细胞存活率。6个T细胞系细胞液氮冻存解冻后细胞的存活率为24.7% ～93.5%，过夜培养后细胞的存活率为2.5% ～72.2%(表1)。CD8 T细胞系细胞的存活率高于CD4 T细胞系细胞(表1)。

2.2 复苏后T细胞系细胞分泌IFN-γ的能力

ELISPOT结果显示，6个复苏后的T细胞系细胞在PHA诱导后能分泌IFN-γ(表2、图1)。

表2 6个T细胞系细胞在ELISPOT实验中形成的斑点数(3个复孔)Table 2 Spot forming units formed by 6 T cell line cells in ELISPOT

图1 ELISPOT检测经PHA刺激复苏后的T细胞系细胞Fig.1 PHA-simulated T cell line cells by ELISPOT

3 讨论

在研究病原感染后机体产生的免疫反应及过继性细胞免疫治疗肿瘤过程中，经常需要将获得的淋巴细胞进行冻存。细胞冻存与解冻可对细胞造成伤害，影响细胞的状态。但加入细胞保护剂，慢冻快复温，调整冻存细胞浓度等可减少冻存解冻过程对细胞的损伤。彭贤贵等［10］检测－80℃条件下不同细胞浓度外周血干细胞冻存效果，结果显示干细胞冻存9个月后细胞回收率在80%以上。本研究中6个T细胞系细胞液氮冻存32～54个月，解冻后细胞的存活率为24.7% ～93.5%，与杨琳等报道的 37.5% ～79.2%相似［11］，但5个细胞系的存活率低于彭贤贵等报道的80%以上［10］。其原因可能是细胞种类、冻存条件及冻存时间等影响细胞的复苏率。本实验发现CD8 T细胞系细胞在冻存复苏后可保持高存活率(93.5%)，远高于CD4 T细胞系细胞(24.7%～61.9%)，而在过夜培养后存活率差别更为明显(2.5%～72.2%)。因为实验仅包括一个CD8 T细胞系，在今后的实验中计划增加CD8 T细胞系样本，以进一步证实在冻存后CD8 T细胞系细胞均较CD4 T细胞系细胞能够保持好的存活率。6个T细胞系细胞解冻后细胞的存活率均高于过夜培养后的存活率，可能的原因是一部分T细胞尽管在解冻时处于活力状态，但已经进入到细胞死亡程序，经过过夜培养后，此部分细胞死亡。

细胞冻存的质量可通过复苏后细胞的功能实验验证。杨琳等［11］应用记忆性抗原 Pediacel及胰岛特异性抗原GAD65刺激复苏后的胰岛抗原特异性T细胞，诱导产生的反应较低。本研究中以多克隆刺激剂PHA为抗原，诱导复苏后的T细胞分泌IFN-γ，结果显示6个T细胞系细胞均能产生明显的IFN-γ分泌。计划以合成的HPV多肽为抗原，检测复苏的HPV特异性的T细胞系细胞是否能够识别HPV抗原并分泌IFN-γ，以进一步明确细胞的冻存解冻过程对抗原特异性T细胞系细胞功能的影响。

［1］Walboomers JM，Jacobs MV，Manos MM，et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide［J］.J Pathol，1999，189(1):12-19.

［2］zur Hausen H.Papillomavirus infections-a major cause of human cancers［J］.Biochim Biophys Acta，1996，1288(2):F55-78.

［3］Bontkes HJ，de Gruijl TD，Walboomers JM，et al.Assessment of cytotoxic T-lymphocyte phenotype using the specific markers granzyme B and TIA-1 in cervical neoplastic lesions［J］.Br J Cancer，1997，76(10):1353-1360.

［4］Chen L，Mizuno MT，Singhal MC，et al.Induction of cytotoxic T lymphocytes specific for a syngeneic tumor expressing the E6 oncoprotein of human papillomavirus type 16［J］.J Immunol，1992，148(8):2617-2621.

［5］Schoenberger SP，Toes RE，van der Voort EI，et al.T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions［J］.Nature，1998，393(6684):480-483.

［6］Kast WM，Bronkhorst AM，de Waal LP，et al.Cooperation between cytotoxic and helper T lymphocytes in protection against lethal Sendai virus infection.Protection by T cells is MHC-restricted and MHC-regulated;a model for MHC-disease associations［J］.J Exp Med，1986，164(3):723-738.

［7］Kim KH，Greenfield WW，Cannon MJ，et al.CD4+T-Cell response against Human Papillomavirus Type 16 E6 protein is associated with a favorable clinical trend［J］.Cancer Immunol Immunother，2012，61(1):63-70.

［8］Nakagawa M，Gupta SK，Coleman HN，et al.A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results［J］.J Low Genit Tract Dis，2010，14(2):124-129.

［9］Wang X，Santin AD，Bellone S，et al.A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(2):301-308.

［10］彭贤贵，陈幸华，刘林，等.80℃条件下不同细胞浓度外周血干细胞冻存效果的实验观察［J］.重庆医学，2003，32(10):1307-1308，1321.

［11］杨琳，超晨，唐维，等.不同的冻存方法对1型糖尿病患者胰岛抗原特异性T细胞反应的影响［J］.中南大学学报(医学版)，2013，38(2):169-175.