一测多评法同时测定板蓝根中4种核苷及(R，S)-告依春

徐小飞，潘雪峰，张慧晔，邓乔华，黄亦南，王德勤

(广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东广州 510515)

(Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Company Limited，Guangzhou 510515，China)

中药成分较为复杂，逐步建立采用多指标成分综合评价中药质量的新模式，更能表征中药化学成分的整体性和复杂性，从而有效地评价中药的质量［1-4］。在中药多指标质量评价过程中，一测多评［5］(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)法由于易于实现多成分的同步测定，在中药大品种的原料、成品生产和检验中备受企业的青睐，其显著的优势在于采用相对校正因子，能够在仅使用一个对照品的情况下，实现多指标成分测定，成为一种适合中药特点的多指标质量评价新模式。并已成功运用于人参、三七、关黄柏等药材中多种成分的定量测定［6-8］。

板蓝根Isatidis Radix来源于十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根。具有清热、解毒、凉血、利咽之功效，是清热解毒类中药的代表药物。 《中国药典》2010年版中板蓝根仅仅使用(R，S)-告依春单一检测指标［9］，不能全面反映板蓝根药材的质量。现代药理研究表明板蓝根中核苷类成分具有抗毒、解热和活血等作用［10-12］。所以，本实验以相对较稳定且对照品易得的腺苷、胞苷和尿苷为对照，考察建立“一测多评”分析方法测定板蓝根中主要活性成分胞苷、腺苷、尿苷、鸟苷和 (R，S)-告依春的量的可行性，为板蓝根药材质量标准的提高及“一测多评”法在中药质控中的推广应用提供了更充分的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)、Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)和Waters 2695-2996高效液相色谱仪 (美国Waters公司)。CP225D十万分之一电子天平 (Sartorius公司)、BT214D万分之一电子天平 (Sartorius公司)、SB25-12DTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)及锥形瓶、漏斗、滤纸等。

1.2 试剂 甲醇 (色谱纯，美国Tedia公司)，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 对照品及样品 腺苷 (批号110879-201202)对照品购自中国药品生物制品鉴定所，鸟苷 (批号106K1848)、尿苷 (批号 1001157075)、胞苷(批号100914316)对照品购自德国SIGMA公司，(R，S)-告依春 (批号111753-201103)对照品购自中国食品药品检定研究院。实验用33批板蓝根药材收集于黑龙江大庆、安徽、河南、河北、陕西、山西、山东日照和甘肃，经广东省中药研究所丘金裕教授鉴定，原植物为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为水-甲醇，梯度洗脱(0～20 min，5% ～5%甲醇;20～30 min，5% ～15%甲醇;30～45 min，15% ～15%甲醇)。体积流量0.5 mL/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量10 μL。色谱峰记录时间为45 min，随后继续运行20 min。上述色谱条件下，各待测组分峰分离效果良好 (分离度＞1.5)，见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、(R，S)-告依春各对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加水制成每1 mL含胞苷0.0212 mg、尿苷0.0382 mg、鸟苷 0.0380 mg、腺苷0.0282 mg、(R，S)-告依春0.2881 mg的混合溶液，摇匀，即得。

图1 对照品和板蓝根样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample of Isatidis Radix

2.1.3 供试品溶液的制备 取板蓝根粉末 (过四号筛)约1 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入水50 mL，称定质量，摇匀，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 分别吸取“2.1.2”项下对照品溶液分别进样1、2、4、6、8、10 μL，以混合对照品溶液中各成分进样体积与峰面积积分值进行线性回归处理，得到胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和(R，S)-告依春的标准曲线。结果表明5种成分在相应的线性范围内线性关系良好，结果见下表1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear regression equations of each component

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，结果胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和 (R，S)-告依春的RSD分别为0.1%、0.2%、0.2%、0.2%、0.8%。表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性考察 取新制备的板蓝根供试品溶液，在室温下放置 0、2、4、8、10、12 h后各精密吸取10 μL进样，胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和(R，S)-告依春色谱峰峰面积的RSD分别为2.0%、1.1%、1.1%、0.5%和1.2%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性考察 取同一批板蓝根药材粉末 (大庆23)，共6份，精密称定，按“2.1.3”项方法制备样品，注入高效液相色谱仪进行测定，计算各成分的量，计算得出胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和(R，S)-告依春的RSD分别为2.2%、1.2%、2.8%、0.7%、2.5%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率 精密称取已知含有量的同一批次样品6份，加入各成分对照品适量，按照“2.1.3”项下方法制备供试液，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样10 μL，按照外标法计算各成分的量，并计算回收率，测定结果见表2。

表2 加样回收率考察结果 (n=6)Tab.2 Results of recorery tests(n=6)

2.2 相对校正因子的计算及其耐用性验证

2.2.1 待测成分相对校正因子的计算 在一定的范围内 (线性范围内)待测成分的量 (W)与检测器响应值 (A)成正比，即W=fA，选取待测成分中一组分k为内标，建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子，即 fkm=fk/fm= (Wk×Am)/(Wm×Ak)。配置一定质量浓度的混合对照品溶液，精密吸取不同体积的同一混合对照品进样分析，分别计算不同进样体积下的fkm，然后计算平均值，并以其作为相对校正因子进行样品测定，见下表3。

表3 待测成分相对校正因子计算结果 (以腺苷为参照成分)Tab.3 Results of relative correction factors of components under test(adenosine as reference)

2.2.2 采用不同高效液相色谱仪测定的耐用性验证 取“2.1.2”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，采用Agilent C18色谱柱，分别在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996高效液相色谱仪上进样检测，求算以胞苷、尿苷及腺苷分别作为参照成分时其他4种成分的相对校正因子，结果说明相对校正因子在使用不同仪器时的耐用性良好，结果见表4。

2.2.3 采用不同C18色谱柱测定的耐用性验证 取“2.1.2”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，在Agilent 1260高效液相色谱仪上，分别采用Agilent C18色谱柱、Dikma Diamonsil C18色谱柱和Hibar RP-18色谱柱进行检测，求算以胞苷、尿苷及腺苷分别作为参照成分时其他4种成分的相对校正因子，使用不同色谱柱测定时各相对校正因子RSD＜1.25%，说明相对校正因子在使用不同色谱柱时耐用性良好，结果见表5。

2.3 待测成分色谱峰的定位 本研究比较了在使用不同仪器及色谱柱进行测定时，保留时间、保留时间差值 (绝对值)及相对保留时间对5种待测成分色谱峰在色谱图上的定位准确度 (以RSD值评价)。各待测成分的保留时间、保留时间差值及相对保留值的RSD值分别为0.21%～1.23%;0.62% ～2.41%;0.20% ～1.27%。由结果可知，保留时间差值的变化范围稍大，保留时间和相对保留时间数值稳定，可以用于待测成分色谱峰的定位，结果见表6、7。

表4 不同液相色谱仪测定的相对校正因子耐用性考察结果Tab.4 Relative correction factors determined with different HPLC instruments

表5 不同C18色谱柱测定的相对校正因子耐用性考察结果Tab.5 Relative correction factors determined on different HPLC columns

表6 板蓝根各成分保留时间结果Tab.6 Resulets of the retention time

表7 板蓝根各成分保留时间差值绝对值和相对保留时间结果Tab.7 Results of differences in retention time and relative retention values

2.4 “一测多评”法与外标法测定结果的比较以腺苷为代表作为“一测多评”的参照成分，计算33批板蓝根药材样品中5种成分的质量分数(Wf)，并与外标法的测定结果 (Ws)进行比较，结果见表8，由表8可见同一成分分别用2种方法求得的含有量值之间均无显著性差异。此外，采用外标法与“一测多评”法所得数据的比值 (Ws/Wf)评价“一测多评”法的准确度，以腺苷作为参照成分时，各成分 (Ws/Wf)的比值在97.48%～104.66%之间。结果表明建立的“一测多评”法的准确度与外标法相当，见表9。

表8 两种方法测定33批板蓝根药材中5种成分的结果Tab.8 Contents of five kinds of Isatidis Radix by QAMS method and standards calibration method

表9 外标法和一测多评法测定5种成分的准确度比较()Tab.9 Comparision of QAMS method and standards calibration method()

表9 外标法和一测多评法测定5种成分的准确度比较()Tab.9 Comparision of QAMS method and standards calibration method()

注:准确度=(Ws/Wf)×100%;Ws为外标法;Wf为一测多评法。表中数据为33批板蓝根药材的x ± s。

成分 RSD/%胞苷101.57±1.01 0.99101.07±3.59 3.55尿苷 100.23±0.76 0.76鸟苷 100.98±0.74 0.73(R，S)-告依春 99.65 ±0.79 0.79总量

3 讨论

3.1 本实验建立了板蓝根中5种有效成分同时测定的“一测多评”方法;在本实验中所采用的液相色谱条件可同时检测到板蓝根中的胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、腺嘌呤和(R，S)-告依春6种成分，实验以外标法的测定结果为标准，以外标法 (Ws)与“一测多评”法 (Wf)分别测得的量的比值(Ws/Wf)评价“一测多评”法计算结果的准确性，结果表明除了腺嘌呤外，其他4种核苷及(R，S)-告依春的量与外标法的测定结果无显著性差异。

3.2 板蓝根中的核苷类成分对照品较难得到，只有腺苷购自国家认可的对照品检定所，另外通过前期研究发现，鸟苷、 (R，S)-告依春稳定性较差。综合以上两点，实验选择了对照品易得且较稳定的腺苷、尿苷和胞苷为参照成分计算校正因子，论文中仅以腺苷为代表进行验证。

3.3 本实验对不同仪器、不同品牌的C18色谱柱及不同波长的相对校正因子的变化进行了研究，结果显示不同仪器和不同C18色谱柱对相对校正因子的影响较小，RSD值均＜3%，说明本方法对于不同仪器和C18色谱柱具有良好的适用性;而在249～259 nm的5个检测波长下RSD值较大，说明本方法得到的相对校正因子受检测波长变化影响较大，因此，在运用本实验建立的“一测多评”法测定时波长为254 nm，不宜较大波动。

3.4 本实验分别采用保留时间、保留时间差值(绝对值)和相对保留时间对待测成分色谱峰进行定位，结果显示除保留时间差值定位准确度稍差外，保留时间和相对保留时间都可以对待测组分峰准确定位。所以在缺乏对照品时，采用本实验提供的相对校正因子及定位方法，选用另外1种成分作为参照时也可得到较好的定位、定量效果。

3.5 由于对照品纯度问题，C18色谱柱填料的性能，不同牌号色谱柱可能有微小差别 (键合相的复盖度、碳含量等)等等均可能带来较大的误差，所以此方法也存在一定的局限性。

［1］何惠芳，赵庆国，郑绯.中药质量控制因素分析［J］.中国煤炭工业医学杂志，2009，12(5):805-807.

［2］赵 超，李会军，陈 君，等.中药复杂成分解析与质量评价的研究进展［J］.中国药科大学学报，2012，43(3):283-288.

［3］李 倩，罗祖良，杨小丽，等.中药质量控制方法研究述评［J］.中医学报，2012，27(4):248-251.

［4］戚 进，余伯阳.中药质量评价新模式— “谱效整合指纹谱”研究进展［J］.中国天然药物，2010，8(3):171-176.

［5］王智民，高慧敏，付雪涛，等.一测多评法中药质量评价模式方法学研究［J］.中国中药杂志，2006，31(23):1925-1928.

［6］朱晶晶，王智民，匡艳辉，等.一测多评法同步测定人参和三七药材中多种人参皂苷的含量［J］.药学学报，2008，43(12):1211-1216.

［7］尹 萌，孟月兰，闻琍毓.关黄柏中生物碱类成分的“一测多评”［J］.中草药，2011，42(6):1093-1096.

［8］林 青，匡艳辉，黄 琳，等.一测多评法测定穿心莲及其制剂中内酯类成分［J］.中草药，2012，43(12):2406-2411.

［9］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:191.

［10］Liu Yunhai，Liu Yufen，Guo Xianxi.Current studies on antiendotoxicchemical components of traditional Chinese medical in China［J］. ActaPharmacologica， 2001， 22(12):1071-1077.

［11］孙广莲，胡志力，孟 红，等.MTT法检测板蓝根抗巨细胞毒效应［J］.山东中医药大学学报，2000，24(2):137-138.

［12］游 松，姚新生，陈英杰，等.中药板蓝根中活血有效成分的研究［J］.中药通报，1988，13(2):31-32.