蓝红胶囊中三七的质量控制方法

花晓薇，李 岩，程雪梅，杨 华，胡高云，王长虹*

(1.上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室上海市复方中药重点实验室，上海 201210;2.新疆医科大学药学院药剂教研室，新疆乌鲁木齐 830011;3.湖南汉森医药研究有限公司，湖南长沙 413000;4.中南大学药学院，湖南长沙 413000)

蓝红胶囊由蓝刺头、杜仲、红花、三七和珍珠等五味药材组成，是在蒙古族民间治疗骨伤科疾病传统验方的基础上开发的新制剂。该药具有活血散瘀、消肿止痛、续筋接骨的作用，用于软组织挫伤、关节扭伤，外伤和手术所致的开放性创伤，肢体骨折等病症［1］。为了对蓝红胶囊进行质量控制，本实验对制剂中三七的质量控制方法进行了研究，建立了三七的薄层鉴别方法，并用HPLC-ELSD法对蓝红胶囊中三七皂苷 R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd进行定量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Linomat-Ⅵ薄层色谱自动点样器 (瑞士CAMAG公司)，Reprostar 3薄层色谱摄像仪(瑞士CAMAG公司)，AE200电子分析天平 (Mettler)，KQ-250DB数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。Agilent1100高效液相色谱仪 (安捷伦公司)，Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检测仪 (美国奥泰科技有限公司)，HWS12型电热恒温水浴锅，Microfuge 18台式微量离心机 (美国贝克曼公司)。

1.2 试药 三七皂苷R1(纯度大于98%)、人参皂苷 Rg1(纯度 96.3%)、人参皂苷 Re(纯度89.1%)、人参皂苷Rb1(纯度92.9%)、人参皂苷Rd(纯度94.4%)，三七对照药材，以上对照品均由中国药品生物制品检定研究院提供;乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。硅胶HSGF254预制板 (烟台江友硅胶开发有限公司);自制蓝红胶囊，批号分别为20120710、20120720、20121012、20121013、20121014、 20121112;通辽市绿茵蒙医药科技开发有限公司提供蓝红胶囊，批号20041225。阴性对照样品按处方除去被测药材，其余药味按蓝红胶囊生产工艺制备，即得。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别试验 取本品1 g，研细，加水5滴，搅匀，再加以水饱和的正丁醇5 mL，密塞，振摇约10 min，放置2 h，离心，取上清液，加3倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，放置使分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

另分别取缺三七的混合药材粉末样品1 g，同法制成阴性对照溶液。取三七对照药材0.3 g，同法制成对照药材溶液。另分别取人参皂苷Rb1、Rg1、Rd对照品及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版附录ⅥB)试验［2］，吸取上述溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水 (4∶1∶5)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸溶液 (1→10)，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。在质量标准制订与实际质量控制中，可以采用对照药材法对蓝红胶囊中的三七药材进行定性鉴别。

图1 蓝红胶囊三七薄层色谱图 (黄海HSGF254板)Fig.1 TLC chromatogram of Notoginseng Radix in Lanhong Capsules

2.2 样品中成分测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱Venusil XBP C18柱;流动相为乙腈-水，梯度洗脱 (0～20 min，20%乙腈;20～30 min，20% ～25%乙腈;30～45 min，25% ～45%乙腈;45～48 min，45% ～90%乙腈);柱温25℃;体积流量1 mL/min;使用蒸发光散射检测器检测。ELSD漂移管温度110℃;载气体积流量2.5 L/min。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 分别取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、和Rd对照品适量，精密称定，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成质量浓度为0.4920、1.8811、0.1728、1.5652、0.4418 mg/mL贮备液。分别精密量取5个单标溶液各5 mL，置于25 mL量瓶中，混合，摇匀，制成含三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Re、Rb1和 Rd分别为 0.0984、0.3762、0.0346、0.3130、0.0884 mg/mL的混合对照品贮备液。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取蓝红胶囊浸膏粉末0.75 g，精密称定，置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，80℃水浴回流4 h，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例及制备工艺，制备不含三七的阴性样品，同法制备阴性对照溶液。

2.2.3 系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按上述色谱条件，分别注入液相色谱仪，色谱图见图2。各待测组分峰的拖尾因子、分离度和塔板数见表1，说明系统适用性良好。

图2 对照品 (A)、蓝红胶囊 (B)、阴性对照 (C)HPLC-ELSD色谱图Fig.2 HPLC-ELSD chromatograms of reference substances(A)，Lanhong Capsules(B)and negative sample(C)

表1 系统适用性试验结果Tab.1 Results of applicability test for chromatographic systems

2.2.4 方法学验证试验

2.2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，进样10 μL，按上述色谱条件测定，分别以对照品的质量对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标，绘制标准曲线。结果三七皂苷 R1在0.1968～1.9680 μg范围内线性关系良好，y=1.74x+4.77，r=0.9996。人参皂苷 Rg1在0.1881～7.5243 μg范围内线性关系良好，y=1.76x+4.83，r=0.9994。人参皂苷 Re在0.1383～0.6914 μg范围内线性关系良好，y=1.39x+4.65，r=0.9993。人参皂苷 Rb1在0.0826～3.1304 μg范围内线性关系良好，y=1.80x+5.20，r=0.9994。人参皂苷 Rd在0.0884～1.7672 μg范围内线性关系良好，y=1.79x+5.24，r=0.9999。

2.2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液连续进样6次，每次10 μL，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rd峰面积的 RSD分别为1.2%、0.7%、3.7%、0.7%、1.3%。表明仪器日内精密度良好。连续5 d测试，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Rd峰面积的RSD分别为 2.9%、1.7%、7.8%、1.6%和2.1%。表明仪器日间精密度良好。

2.2.4.3 重复性试验 取同一批蓝红胶囊样品(批号20121012)6份，精密称定，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定其三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Rd的量，其 RSD分别为0.8%、0.2%、2.7%、0.5%、1.7%，表明方法重复性良好。

2.2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、3、6、12、24、48、72 h各进样10 μL，测定峰面积，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷 Rd的 RSD分别为 2.2%、0.4%、5.2%、1.4%、1.6%，表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.2.4.5 回收率试验 取已知含有量的供试品(批号20121012)0.37 g，精密称定，共9份，分成3组，置50 mL圆底烧瓶中，分别精密加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷 Rd对照品溶液适量，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，计算回收率，结果见表2。

2.2.5 样品测定 取7批蓝红胶囊样品，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，结果见表3。

3 讨论

3.1 关于中药复方制剂中三七的质量控制方法，文献主要以薄层色谱法和高效液相色谱法为主［3-7］。蓝红胶囊成分较复杂，各成分之间存在相互干扰，试验的关键是选择适宜的展开系统。在蓝红胶囊中三七的薄层色谱鉴别，采用正丁醇-乙酸乙酯-水 (4∶1∶5)上层溶液为展开剂时，在不同类型硅胶薄层板上均可以达到理想的分离效果。薄层鉴别的耐用性试验中比较了不同厂家、规格的薄层预制板、不同的湿度、温度、显色剂对试验结果的影响，在不同条件下，均有较好的展开效果，表明该方法耐用性良好。

3.2 定量测定供试品溶液的制备方法考察中，对提取溶剂、提取方法、提取时间及提取次数进行了考察，结果以80%甲醇为提取溶剂，回流4 h提取效果最佳。通过与《中国药典》2010年版三七药材供试品溶液的制备方法进行比较，本法所测得5种指标成分含有量均显著高于药典法，且本方法操作更加简便。另外，通过对不同色谱柱、体积流量、柱温等因素进行考察，系统适用性较好，具有良好的耐用性。

表2 加样回收试验结果Tab.2 Results of recovery tests

表3 蓝红胶囊测定结果 (n=3)Tab.3 Content determination of Lanhong Capsules(n=3)

3.3 通常，三七中皂苷类成分的分析常使用较低的紫外检测波长 (203 nm)，但该波段为末端吸收，噪音信号很大。用于蓝红胶囊供试品溶液测定时，存在基线漂移不稳，干扰多等缺点，导致定量不准确。蒸发光散射检测器 (ELSD)是一种新型的通用性质量检测器［8］。ELSD的响应不依赖样品的光学性质［9］，任何挥发性第一流动相的样品均能被检测［10］，并且能与梯度洗脱方式相容，灵敏度高于紫外末端吸收检测法［11-12］。通过调节ELSD检测器的参数，可以使基线噪音最小，响应值相对最高［13］。采用HPLC-ELSD法测定蓝红胶囊三七中皂苷类成分含有量，准确、可靠、重复性好、专属性强，为蓝红胶囊的质量控制提供了依据。

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