HPLC法测定兔房水中羟基红花黄色素A

何梅凤，吴 伟，邓新国

(中山大学中山眼科中心，广东广州 510060)

羟基红花黄色素A具有抗凝、抗缺氧、降血压、改善心脑血管供血不足等作用，临床可用于防治心肌缺血、脑缺血、冠心病、脑血栓等疾病［1-3］。近年来随着对羟基红花黄色素A药理作用机理研究的日益深入，在眼科方面也取得一定进展，羟基红花黄色素A可在体外保护晶状体免受氧化损伤，阻止脂质过氧化过程和白内障的形成［4］;在高糖下如糖尿病视网膜病变中可能抑制新生血管的生成，有望成为糖尿病视网膜病变的有效治疗药物［5］，显示出其在眼科疾病的治疗有很好的应用前景。目前，关于羟基红花黄色素A在体内定性、定量测定的分析方法已有报道［6］，但以血样中的量测定为主，全身用药在眼房水中的吸收情况尚未见报道。本实验采用红花黄色素A兔静脉注射并测定了房水中药物浓度，为其在眼科的临床应用提供参考依据，现将结果报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪及其化学工作站(美国Agilent公司);TGL－16G台式离心机 (上海安亭科学仪器厂);SK-1型快速混匀器 (江苏金壇医疗仪器厂);电子分析天平 (德国Sartorius公司)。

1.2 药品与试剂 羟基红花黄色素A对照品 (中国食品药品检定研究院，批号111637-201106，纯度92.5%);注射用红花黄色素 (浙江永宁药业股份有限公司，批号110610);乙腈、甲醇为色谱纯;磷酸为分析纯;水为注射用水。

1.3 实验动物 新西兰兔由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供。

2 方法与结果

2.1 羟基红花黄色素A对照品溶液的配制 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇溶解并稀释至每1 mL含5.60 μg的溶液，即得。

2.2 给药及样品采样 取3只新西兰兔，静脉注射红花黄色素10 mg/kg，30 min后，采取耳缘静脉空气栓塞处死兔，取房水置－20℃冰箱备用。

2.3 房水样品的处理 分别取兔房水0.2 mL，各加6%高氯酸0.2 mL，漩涡振荡混匀1 min，10000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样测定。

2.4 色谱条件及方法的专属性考察 色谱柱为Diamonsil C18柱;流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72);体积流量为0.8 mL/min;检测波长为403 nm;柱温为50℃;进样量20 μL。在上述色谱条件下，分别取空白房水样品、羟基红花黄色素A对照溶液以及房水样品进样，记录色谱图，结果显示，羟基红花黄色素A的保留时间约为11 min，峰尖而对称，无其他峰干扰，表明该方法可行。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.5 线性范围 分别精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，分别取溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。将峰面积 (A)与质量浓度 (C)做线性回归，得羟基红花黄色素A的线性回归方程为:A=69.1588 C–0.6947，相关系数r=0.9998。结果表明，羟基红花黄色素A在0.28～4.48 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 回收率试验 取兔空白房水，分别精密加入羟基红花黄色素A对照品溶液和甲醇，配制高、中、低3个质量浓度的羟基红花黄色素A房水液，按“样品处理”项下操作并进行分析，求得羟基红花黄色素A在空白房水中的回收率。结果见表1。

表1 回收率试验结果 (n=3)

2.7 精密度试验 取高、中、低3个质量浓度的羟基红花黄色素A房水液，于日内的不同时间和不同的日间分别进样5次，考察日内与日间的精密度，结果日内精密度为3.85%、3.48%、5.04%，日间精密度为5.13%、4.26%、5.61%(n=5)。

2.8 稳定性试验［7-8］取高、中、低3个质量浓度的羟基红花黄色素A房水液，于室温放置0、6、12 h及在－20℃冷冻保存3 d后，分别经样品处理并测定羟基红花黄色素A的质量浓度，结果表明具有良好的稳定性，RSD＜6.5%。

2.9 样品测定 取静脉注射红花黄色素30 min后的兔眼房水样品 (6只眼)，按“2.3”项处理，测定羟基红花黄色素A在房水中的浓度，具体结果见表2。

表2 房水中羟基红花黄色素A测定结果 (n=6，)

表2 房水中羟基红花黄色素A测定结果 (n=6，)

样品号 羟基红花黄色素A/(μg·mL－1) 平均/(μg·mL－1)12.5822.2532.1142.1752.7162.822.44±0.3

3 讨论

红花黄色素为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物，而羟基红花黄色素A是其混合物中主要的有效成分，因此，羟基红花黄色素A常作为应用红花黄色素后在体内某组织的浓度的考察指标。目前，羟基红花黄色素A的测定多采用高效液相色谱法［9-14］，但色谱条件及样本处理方法各有不同，主要采用甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液，乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液，乙腈-甲醇-水，甲醇-乙腈-1.2% 磷酸二氢钾溶液以及甲醇-水-冰醋酸等不同的配比作为流动相，而样品处理多采用高氯酸，也有采用乙腈和甲醇处理生物样本后对羟基红花黄色素A进行测定。

本研究参照《中国药典》项下的流动相组成［15］，并对柱温和体积流量加以优化，选用高氯酸沉淀房水中的微量蛋白，甲醇－乙腈－0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72)为流动相，在波长为403 nm下对兔静脉注射房水中的羟基红花黄色素A质量浓度进行了测定，通过方法学验证，本方法具有准确、可靠、快速等优点，适用于对房水羟基红花黄色素A的测定。研究结果表明，羟基红花黄色素A通过静脉注射能透过血眼屏障，进入房水，这一结果为其全身用药治疗眼部疾病提供了实验依据。后续将进一步研究羟基红花黄色素A在房水中的药动学行为，为临床合理用药提供参考。

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