4种不同桑叶提取物降血糖作用的筛选

孟庆海，殷秋忆，郭 静，卞慧敏

(南京中医药大学，江苏南京 210046)

桑叶是桑科植物桑树的干燥叶，在全国大部分的地区均有生长。桑叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎等作用，由于其含有黄酮类、生物碱类、植物甾醇、γ-氨基丁酸及桑叶多糖等多种物质，因此桑叶具有广泛的生物活性和临床应用［1-3］。桑叶的药用作用很明确，1993年卫生部即确定了桑叶既是食品又是药品。从古至今，桑叶作为治疗消渴症 (即现代医学的糖尿病)的中药应用于中医临床［4］。但由于桑叶的采收期、产地等的不同，其品质差异很大［5］，临床疗效也会产生巨大的差异。因此本实验对桑叶中的主要成分进行了降血糖作用的筛选，并将筛选的有效部位进行配比，以期望为临床应用提供质量可控、疗效确切的新制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物和试剂 格列苯脲片 (天津太平洋制药有限公司);阿卡波糖 (杭州中美华东制药有限公司);二甲双胍(北京中惠药业有限公司);4种桑叶提取物，即桑叶多糖、桑叶生物碱、桑叶总黄酮、桑叶提取物 (镇江吉贝尔药业有限公司);四氧嘧啶 (SIGMA公司);淀粉 (南京化学试剂有限公司);葡萄糖 (南京化学试剂有限公司);氯化钠(南京化学试剂有限公司);葡萄糖测定测试盒 (南京建成生物研究所)。

1.1.2 动物 ICR小鼠，体质量18～22 g，雄性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2012-0002。使用许可证号:SYXK(苏)2012-0042。

1.1.3 仪器 低速自动平衡离心机 (北京医用离心机厂);BioTek酶标仪 (美国BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的制备 ICR种小鼠禁食不禁水12 h后，尾静脉注射四氧嘧啶85 mg/kg(四氧嘧啶溶于0.9%氯化钠中，现配现用，避光冰浴保存)，正常对照组尾静脉注射相同容积生理盐水。60 h后，禁食12 h，眼眶取血，37℃恒温培养箱孵育30 min，3000 r/min离心，分离血清测血糖，取血糖值11 mmol/L以上的小鼠为糖尿病模型动物。

1.2.2 糖尿病小鼠降血糖试验 有效部位的筛选:将造模成功的小鼠按血糖值随机分为模型组、桑叶多糖组、桑叶生物碱组、桑叶总黄酮组、桑叶提取物组及阳性药格列本脲1.95 mg/kg组，灌胃给药，筛选药物给药剂量按生药量计算为20 g/kg，模型组灌胃等容积的水，每日1次，连续10 d。在确认有效部位后，采用均匀设计 (见表1)进行有效部位最佳配比的确定。最后用最佳配比进行验证:将造模成功的小鼠按血糖值随机分为模型组，桑叶生物碱+桑叶总黄酮低剂量 (90+15)mg/kg组、中剂量 (180+30)mg/kg组、高剂量 (360+60)mg/kg组，阳性药物阿卡波糖39 mg/kg组，灌胃给药，模型组灌胃等容积的水，每日1次，连续10 d。测定给药5 d后、10 d后血糖。

因素1总黄酮7个水平的质量浓度为按照2因素7水平均匀设计表配制药物见表2中1～7，8仅含有总黄酮，9仅含有总生物碱。每组按表中的质量浓度取样，各配制50 mL(用蒸馏水配置)。

表1 2因素7水平均匀设计

表2 各组给药剂量配比

将造模成功的小鼠按血糖值随机分为编号1组 (12只)、2组 (11只)、3组 (12只)、4组 (10只)、5组(11只)、6组 (11只)、7组 (10只)、8组 (10只)、9组 (10只)及模型组 (10只)，总黄酮得率为1.2%(12 mg总黄酮相当于1 g生药)，总生物碱得率为0.2%(2 mg总生物碱相当于1 g生药)，按表2配制药物后小鼠按10 mL/kg体质量灌胃给药。因素1总黄酮给药剂量的7个水平为 (1)200 mg/kg， (2)300 mg/kg， (3)400 mg/kg，(4)500 mg/kg， (5)600 mg/kg， (6)700 mg/kg， (7)800 mg/kg。因素2总生物碱给药剂量的7个水平为 (1)25 mg/kg， (2)50 mg/kg， (3)75 mg/kg， (4)100 mg/kg，(5)125 mg/kg，(6)150 mg/kg，(7)175 mg/kg。模型组灌胃等容积的水，每日1次，连续10 d。

1.2.3 正常小鼠糖耐量试验

1.2.3.1 多糖糖耐量 取正常小鼠50只按血糖值随机分为5组，空白对照组，阿卡波糖39 mg/kg组，桑叶总黄酮+桑叶总生物碱 (90+15)mg/kg、(180+30)mg/kg、(360+60)mg/kg 3个剂量组，小鼠禁食12 h后单次灌胃给药，空白组给予等体积的水，给药1 h后，眼眶取血测定0 h时血糖。之后各组均给予10%淀粉溶液3 g/kg，灌胃淀粉后30、60、120 min眼眶取血测各组动物的血糖。

1.2.3.2 单糖糖耐量 取正常小鼠50只按血糖值随机分为5组，空白对照组，二甲双胍130 mg/kg组，桑叶总黄酮+桑叶总生物碱 (90+15)mg/kg、(180+30)mg/kg、(360+60)mg/kg 3个剂量组，小鼠禁食12 h后单次灌胃给药，空白组给予等体积的水，给药1 h后，眼眶取血测定0 h时血糖。之后各组均给予葡糖糖溶液3 g/kg，灌胃葡萄糖溶液30、60、120 min后眼眶取血测各组动物的血糖。

1.2.4 统计学方法数据 以SPSS 19.0软件统计，采用单因素方差分析，结果以表示，两组数据间的显著性采用t检验进行统计，P＜0.05认为有显著性差异。

2 结果

2.1 不同桑叶提取物对糖尿病小鼠血糖的影响 与模型组比较，各给药组在给药第5天后血糖值均有下降，格列苯脲组、桑叶生物碱组、桑叶总黄酮组与模型组比较差异有显著性 (P＜0.05，P＜0.01)，且桑叶生物碱和总黄酮降血糖作用优于多糖和其他。桑叶生物碱组、桑叶总黄酮组给药第10天仍可见降低血糖作用，与模型组比较差异亦有显著性 (P＜0.05，P＜0.01)。在给药第10天桑叶其他组也可见血糖下降，与模型组比较差异也有显著性 (P＜0.05)。桑叶多糖组血糖有降低的趋势，但与模型组比较无显著性差异。总之，桑叶不同成分的降血糖作用，生物碱和总黄酮明显优于多糖和桑叶其他部位，因此后续实验选用生物碱和总黄酮进行。见表3。

表3 不同桑叶提取物对糖尿病小鼠血糖的影响 ()

表3 不同桑叶提取物对糖尿病小鼠血糖的影响 ()

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

10 d模型组 等容积组 别 剂量/(生药g·kg－1) 动物数/只 血糖/(mmol·L－1)给药前 给药后5 d 给药后14.5±4.0 21.9±5.1 24.1±4.6格列苯脲 0.00195 8 15.6±6.4 14.8±7.3* 16.2±5.8多糖 20 9 15.9±5.9 17.3±6.2 19.2±5.5生物碱 20 11 15.1±4.5 11.9±8.0＊＊ 12.5±6.8＊＊总黄酮 20 8 15.0±5.0 12.3±5.5＊＊ 13.6±6.3*其他提取物 20 10 14.8±4.7 19.8±6.8 17.6±6.77*

2.2 应用均匀设计试验筛选桑叶提取物生物碱和总黄酮的最佳降血糖作用配比 与模型组比较，9个水平给药组在给药第5天后，除编号4组外，其余各给药组均显示出降糖效应，与模型组比较差异有显著性 (P＜0.05，P＜0.01)，第10天各给药组均有降糖作用，与模型组比较差异有显著性 (P＜0.05，P＜0.01)，其中降糖作用最好的是2、3组，结合药材的合理应用，本实验选择2组即总黄酮和总生物碱的比例为6∶1进行下面的实验。见表4。

2.3 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对糖尿病小鼠血糖的影响与模型组相比，各给药组在给药第5天血糖值均有下降，除低剂量组外，其他各组均有显著性 (P＜0.05，P＜0.01);给药10 d后，各给药组与模型组比较血糖值下降明显，且有显著性差异 (P＜0.01)。见表5。

表4 不同桑叶提取物配比对糖尿病小鼠血糖的影响 ()

表4 不同桑叶提取物配比对糖尿病小鼠血糖的影响 ()

注:与模型组比较，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

10 22.9±6.3 25.0±4.6 24.5±3.81200+125 12 23.1 ±5.3 17.6 ±4.5＊＊ 19.6 ±2.3＊＊2300+50 11 22.2 ±4.3 17.9 ±3.3＊＊ 15.9 ±3.9＊＊3400+175 12 23.6 ±6.5 17.3 ±7.7＊＊ 15.8 ±4.4＊＊4500+100 10 21.3±5.9 21.1±6.0 16.4±5.9＊＊5600+25 11 20.8 ±5.6 18.0 ±5.5＊＊ 18.5 ±4.2＊＊6700+150 11 22.6±6.6 17.4±6.4＊＊ 18.9±6.0*7800+75 10 23.1±5.7 19.2±5.4* 18.9±4.2＊＊8500+0 10 24.2±5.5 20.3±5.4* 17.6±6.5＊＊10 d模型组 等容积组 别 (黄酮+生物碱)/(mg·kg－1) 动物数/只 血糖/(mmol·L－1)给药前 给药5 d 给药90+100 10 23.0±6.3 20.6±3.2* 20.5±2.0＊＊

表5 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对糖尿病小鼠血糖的影响 ()

表5 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对糖尿病小鼠血糖的影响 ()

注:与模型组比较，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

10 d模型组 等容积组 别 剂量/(mg·kg－1) 动物数/只 血糖/(mmol·L－1)给药前 给药后5 d 给药后10 16.44±3.45 14.46±3.36 11.21±0.68阿卡波糖组 39 12 14.30±3.20 3.98±2.00＊＊ 7.91±2.44＊＊90+15 10 17.10±6.75 13.76±2.86 8.27±2.70＊＊桑叶总黄酮+总生物碱 180+30 11 14.68±3.43 9.09±5.71* 7.53±2.84＊＊360+60 10 15.05±5.87 4.29±3.01＊＊ 6.14±2.30＊＊

2.4 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对正常小鼠糖耐量的影响

2.4.1 多糖糖耐量 给药1 h后，0时血糖值各组间均无显著性差异且血糖值极低;给淀粉0.5 h后各组血糖与0时血糖相比较均显著升高，但空白组明显比其余各组升高程度大，阿卡波糖与空白组相比较有显著性的差异 (P＜0.01);给淀粉1 h后，血糖持续升高，各组升高程度仍低于空白组，其中阿卡波糖组和桑叶总黄酮+总生物碱 (360+60)mg/kg组与空白组相比较有显著性的差异 (P＜0.05，P＜0.01);给淀粉2 h后，空白组血糖与给淀粉1 h后略有降低，其余各组略有升高，但升高程度仍低于空白组，且阿卡波糖组、桑叶总黄酮+总生物碱 (180+30)、(360+60)mg/kg组与空白组相比较有显著性差异 (P＜0.05，P＜0.01)。见表6。

表6 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对正常小鼠多糖糖耐量的影响 ()

表6 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对正常小鼠多糖糖耐量的影响 ()

注:与模型组比较，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

0 h 0.5 h 1 h 2 h空白组 等容积组 别 剂量/(mg·kg－1) 动物数/只 血糖/(mmol·L－1)10 0.63±0.33 6.39±2.75 8.09±2.41 7.85±2.22阿卡波糖组 39 10 0.79±0.52 3.29±1.42＊＊ 5.32±1.94* 5.7±1.87*90+15 10 0.62±0.2 4.9±1.5 7.33±2.52 7.84±2.17桑叶总黄酮+总生物碱 180+30 10 0.62±0.66 4.97±1.36 6.01±2.1 5.65±1.55*360+60 10 0.65±0.84 5.16±1.48 4.46±1.21＊＊ 4.92±1.8＊＊

2.4.2 单糖糖耐量 给药1 h后，0时血糖值各组间均无显著性差异且血糖值极低;给葡萄糖0.5 h后各组血糖与0时血糖相比较均显著升高，但空白组明显比其余各组升高程度大，各给药组与空白组相比较有显著性的差异 (P＜0.01，P＜0.01);给淀粉1 h后，各组血糖开始降低，除桑叶提取物 (90+15)mg/kg组外，其余给药组与空白组相比较有显著性的差异 (P＜0.01);给淀粉2 h后，各组血糖继续降低，空白组血糖与给淀粉1 h后相比略有降低，各给药组与空白组相比较有显著性差异 (P＜0.01)。见表7。

表7 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对正常小鼠单糖糖耐量的影响 ()

表7 桑叶生物碱+桑叶总黄酮对正常小鼠单糖糖耐量的影响 ()

注:与模型组比较，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

0 h 0.5 h 1 h 2 h空白组 等容积组别 剂量/(mg·kg－1) 动物数/只 血糖/(mmol·L－1)10 0.39±0.51 7.89±1.31 4.11±0.83 3.99±0.62二甲双胍组 130 10 0.23±0.26 4.49±2.07＊＊ 2.63±1.16＊＊ 2.63±0.57＊＊90+15 10 0.39±0.29 5.9±1.82* 3.54±1.59 3.06±0.75＊＊桑叶总黄酮+总生物碱 180+30 10 0.22±0.17 5.35±1.98* 2.88±0.93＊＊ 2.23±0.41＊＊360+60 10 0.34±0.18 5.22±1.6* 2.14±0.85＊＊ 1.55±0.98＊＊

3 讨论

2007—2008年国内流行病学调查显示，20岁以上的成年人糖尿病患病率为9.7%［6］。如今更进一步增多。糖尿病有多种并发症，很多并发症较难治愈［7-8］，而高血糖是这些并发症的起始诱导因素，因此降低糖尿病患者的血糖就尤为重要。桑叶自古就是治疗糖尿病的中药，如今桑叶在临床的应用更为广泛［3］。桑树在中国种植多，分布广。但由于不同地区的桑叶中的各种成分的量并不相同［2，5］，导致桑叶的应用有很大的局限性。但若将桑叶中降血糖作用的有效部位提取分离并筛选出来，必将为临床提供新的治疗选择。

有效部位的筛选试验利用四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型，通过双盲法筛选桑叶提取物中降血糖作用较好的部位［9］。结果表明，在桑叶的4个提取物中 (桑叶多糖、桑叶生物碱、桑叶总黄酮、桑叶其他提取物)，总生物碱和总黄酮降血糖的作用较其他提取物明显。杨旭也对桑叶总生物碱进行了提取并证明到了其具有较好的降糖作用［10］;陈玲玲等也研究了桑叶黄酮对糖尿病小鼠血糖的调节作用，桑叶黄酮能显著降低糖尿病小鼠血糖［11］。大量的文献均报道桑叶黄酮和桑叶生物碱均具有有良好的降糖作用［12-14］。考虑到合用桑叶黄酮和生物碱后可能能提高降糖效果，降低药物的用量，并提高药材利用率，因此本实验应用均匀设计试验法作验证。

筛选实验结束后，应用二因素七水平均匀设计表将桑叶生物碱和桑叶总黄酮按不同配比合用给予糖尿病小鼠［9，15］，结果显示不同配比的桑叶总黄酮和桑叶生物碱均能降低糖尿病小鼠血糖，其中又以编号2组［黄酮+生物碱 (300+50)］、编号3组 ［黄酮+生物碱 (400+175)］最优，考虑到药物的总用量及原药材中总黄酮与总生物碱的得率比6∶1，因此后续试验选取编号2组进行 (总黄酮∶总生物碱为6∶1)。编号2组中小鼠灌胃量为总黄酮300 mg/kg+生物碱为50 mg/kg，转换为生药量为:总黄酮300 mg/kg÷12 mg/g=25 g/kg，总生物碱 50 mg/kg÷2 mg/g=25 g/kg。因此编号2组小鼠给药量按生药计算为25 g/kg。这与第一步筛选时，4种提取物单用时的给药计量20 g/kg也较为接近。后续试验仍用此配比进行，并设计了按桑叶总黄酮和总生物碱计算的 (90+15)mg/kg、(180+30)mg/kg、(360+60)mg/kg三个剂量组。

本实验应用糖尿病小鼠模型降糖试验和正常小鼠糖耐量实验验证了总黄酮 ∶总生物碱为6∶1应用后的作用，该有效部位的组合能降低糖尿病小鼠血糖，提高正常小鼠对淀粉和葡萄糖的耐受能力，并存在剂量的依赖性。说明桑叶生物碱和总黄酮在合并应用后具有较好的降糖效果，同样说明桑叶提取物降低血糖的机制并不唯一，可能通过抑制糖苷酶，进而抑制双糖的分解和吸收，也可能直接提高了胰岛素的敏感性，抑制了葡糖糖在肠道的吸收。合并后的桑叶提取物降血糖的机制和优势有待于进一步研究。本研究为桑叶临床治疗糖尿病提供科学依据，可为防治糖尿病药物的进一步开发提供参考。

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