柱前衍生化法测定化学合成丹皮酚中硫酸二甲酯残留量

方金红

(安科余良卿药业公司，安徽安庆 246001)

丹皮酚作为牡丹皮(Moutan Cortex)的主要有效成分，具有镇静、抗炎、抗过敏、抗氧化等作用，近年来受到越来越多的关注［1-3］。丹皮酚可以在植物体中萃取，但是受到资源限制，产量不高。利用化学原料人工合成丹皮酚，价廉易得，操作简单，适合工业化生产。丹皮酚的人工合成工艺大致包括将间苯二酚乙酰化制得2，4-二羟基苯乙酮，再经甲基化制得2-羟基-4-甲氧基苯乙酮(丹皮酚)两个步骤。而硫酸二甲酯(DMS)作为一种良好的甲基化试剂，被广泛运用于丹皮酚的化学合成［4-7］。但DMS剧毒，对局部黏膜有强烈的刺激和腐蚀作用，急性中毒后可能导致染色体突变，产生致畸致癌作用［8-10］。故应有一种准确而灵敏的分析方法来检测化学合成丹皮酚中的硫酸二甲酯残留以控制其限量。本方法运用柱前衍生的方法，将硫酸二甲酯与对硝基苯酚在碱性及加热的条件下发生反应生成对硝基茴香醚，再通过紫外检测器对其衍生产物进行检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 岛津GC-2010型气相色谱仪，岛津LC-20AD型液相色谱仪，岛津RID-10A示差折光检测器，梅特勒-托利多AL-204型电子天平，毛细管柱(PEG-20M，30 m × 0.53 mm ×1 μm，兰州中科凯迪化工新技术有限公司)，液相色谱柱(C18，250 mm ×4.6 mm × 5 μm，YMC)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(GC，Tedia，1101545)，二甲基亚砜(DMSO)(GC，阿拉丁，J1330031)，正己烷(HPLC，Tedia，12100708)，异丙醇(HPLC，Tedia，13020422)，甲醇(HPLC，Sigma-aldrich)，硫酸二甲酯(工业级，山东兴辉化工，121214)，对硝基苯酚(AR，国药集团，20130222)，NaOH(AR，上海苏懿化学试剂有限公司，20121030)，丙酮(AR，上海中试化工总公司，20120103)，乙醚(AR，上海中试化工总公司，20111206)，对硝基茴香醚(AR，Aladdin Industrial Corporation，E1331040)，化学合成丹皮酚(合肥立方制药股份有限公司，130510，130517，130522)。

图1 硫酸二甲酯气相色谱法检测图谱

1.2 气相色谱法［11］程序升温:50℃保持3 min，以30℃·min-1升温至180℃，保持6 min;进样口温度:200℃;FID 温度:250℃;柱流速:6 mL·min-1;分流比:10∶1。分别用 DMF及 DMSO为溶剂，制成每毫升含硫酸二甲酯约50 μg的供试溶液，进样2 μL，记录色谱图，见图1。

1.3 正相液相色谱法［12］流动相:正己烷—异丙醇=70∶30;流速:1.0 mL·min-1;RID-10A 示差折光检测器。以流动相为溶剂，制成每毫升含硫酸二甲酯10 μg的供试溶液，进样20 μL，记录色谱图，见图2。

图2 硫酸二甲酯正相液相色谱—示差法检测图谱

1.4 柱前衍生—高效液相色谱法［13-14］

1.4.1 反应原理 硫酸二甲酯在碱性和加热的条件下与对硝基苯酚反应生成对硝基茴香醚，经C18柱分离，用紫外检测器检测(305 nm)。以保留时间定性，峰面积定量。反应方程式如下:

1.4.2 实验操作 取10 mL丙酮加于100 mL量瓶中，精密称定，加入数滴硫酸二甲酯，精密称定，两次称量之差即为硫酸二甲酯的质量。加丙酮稀释至刻度，计算每毫升溶液中硫酸二甲酯的含量，临用前配制。取2 mL硫酸二甲酯丙酮溶液，加0.4 g对硝基苯酚，8 mL 0.3%氢氧化钠溶液，充分混匀。在40℃水浴中恒温1 h，取出冷至室温。用10 mL乙醚在分液漏斗中提取3 min，静置分层。精密量取20 μL乙醚提取液作为对照溶液进样。取化学合成丹皮酚约3 g，精密称定，加丙酮溶解，取2 mL，同法操作，制得乙醚提取液作为供试溶液，精密量取20 μL 进样。

1.4.3 色谱条件 检测波长:305 nm;柱温:55℃;流动相:甲醇∶水 =25∶75;流速:1.0 mL·min-1;进样 20 μL，记录色谱图，见图 3。

图3 硫酸二甲酯柱前衍生—高效液相色谱法检测

2 结果

2.1 反应条件对衍生产物转化率的影响 试验考察了不同反应时间、不同反应温度、不同氢氧化钠的浓度条件下，硫酸二甲酯生成对硝基茴香醚的衍生反应转化率。在所考察的不同反应时间、反应温度、加入氢氧化钠浓度等反应条件范围内，衍生反应的转化率几乎没有变化，较为稳定，结果见表1。

2.2 精密度

2.2.1 进样精密度 在柱前衍生—高效液相色谱法色谱条件下，取上述硫酸二甲酯反应后的乙醚提取液，连续进样6针，各硫酸二甲酯衍生产物的峰面积RSD小于2.0%，说明仪器的进样精密度良好。

2.2.2 日内精密度 按1.4.2项下对照溶液制备方法制备硫酸二甲酯溶液7份，1份作为对照，其余6份作为供试，反应后分别测定供试中硫酸二甲酯衍生产物的含量，计算RSD=1.69%(n=6)，结果见表2。

表1 不同反应条件衍生产物的转化率

2.2.3 日间精密度 按日内精密度试验方法，在不同的时间，由不同的人员，在不同的仪器上测定样品溶液的峰面积并计算含量(标示量%)，计算两次试验的精密度，RSD=1.89%(n=12)，结果见表3。

2.3 定量限与检测限 本方法测定硫酸二甲酯残留的最低检测限为0.82 ng，最低定量限为2.44 ng，定量限浓度样品6次连续进样的结果保留时间的RSD值小于2%，峰面积的RSD值小于10%。

2.4 线性与范围 在硫酸二甲酯为0.122～1.220 mg·L-1的浓度范围内，浓度C(mg·L-1)与峰面积A呈良好的线性关系，结果见表4。

表2 日内精密度试验结果(n=6)

表3 日间精密度试验结果(n=12)

表4 线性与范围试验结果

2.5 加样回收率 分别制备加入高、中、低硫酸二甲酯浓度的丹皮酚供试溶液各3份，按外标法以峰面积计算硫酸二甲酯的测得量，测得硫酸二甲酯的平均回收率在80% ～120%范围内，平均回收率为98.8%，RSD=1.4%(n=9)，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果

2.6 稳定性 按硫酸二甲酯对照溶液的制备方法，制备硫酸二甲酯溶液，反应后分别在不同的时间用两台液相色谱仪器(一台进样器控温为4℃，另一台不控温)检测硫酸二甲酯衍生产物的峰面积，检测结果如下:4℃时，在0、2、4、8、12、24 h 时，峰面积分别为 6 753、6 804、6 816、6 934、6 859、6 957，平均峰面积为6 854，RSD为1.15%(n=6);常温时，在 0、1、2、3、4 h 时，峰面积分别为 6 526、6 633、7 016、7 409、7 537，平均峰面积为 7 024，RSD 为6.42%(n=5)。

2.7 样品检测结果 分别取3个批次化学合成丹皮酚样品，按拟定的方法进行测定，均未检出硫酸二甲酯的残留。

3 讨论

硫酸二甲酯无紫外吸收，尝试分别采用GC法、HPLC-RID法进行试验。试验表明，硫酸二甲酯遇高温分解，用直接进样的GC法检测时裂分成3～4个峰;HPLC-RID法的灵敏度过低，定量限高达约200 ng，无法满足限度控制要求。

运用柱前衍生化高效液相色谱法检测化学合成丹皮酚中的硫酸二甲酯残留，衍生反应的转化率较高且稳定，耐用性好，丹皮酚样品不干扰对硫酸二甲酯的检测，专属性好，检测限(0.82 ng)及定量限(2.44 ng)均满足限度控制要求，灵敏度高，在0.122～1.220 mg·L-1的浓度范围内浓度与峰面积的线性关系良好，高、中、低三个浓度平均加样回收率98.8%，准确度高，方法日内、日间精密度均良好。本法适用于化学合成丹皮酚中硫酸二甲酯残留的检测。运用本法测定化学合成丹皮酚中硫酸二甲酯残留时需注意，由于用于检测的供试溶液为乙醚提取物，乙醚极易挥发，在常温时应立即检测或将供试溶液低温保存。

［1］ Li H，Wang SW，Zhang BL，et al.Simultaneous quantitative determination of 9 active components in traditional Chinese medicinal preparation ShuangDan oral liquid by RP-HPLC coupled with photodiode array detection［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，56(4):820-824.

［2］ 马 嘉，李 蔚，陈 瑞.丹皮酚渗透泵片包衣膜处方工艺考察［J］.安徽医药，2013，17(5):754-757.

［3］ 刘雁丽，韦柳成，沈振国，等.丹皮酚的药理作用、提取及含量测定方法研究进展［J］.安徽医药，2011，15(7):896-899.

［4］ 汪显阳，朱贞石，胡瑞芳.正交设计法优选丹皮酚的合成工艺［J］.中国药物化学杂志，1993，3(3):187-189.

［5］ 高 鑫，陈光勇，刘光明.丹皮酚的合成研究［J］.大理学院学报，2008，7(4):3-4.

［6］ 薛 芬，戴华娟，王建中，等.丹皮酚(2-羟基-4-甲氧基苯乙酮)的合成［J］.上海第一医学院学报，1984，11(4):312-313.

［7］ 胡春弟，张 杰.丹皮酚的药理作用及合成研究进展［J］.化学与生物工程，2009，26(8):16-18.

［8］ 邓桂凤，姚彤炜.顶空气相色谱法测定盐酸格拉司琼中硫酸二甲酯残留量［J］.浙江大学学报(医学版)，2008，37(2):156-158.

［9］ 吴平谷.大口径毛细管柱气相色谱法测定土壤中硫酸二甲酯含量［J］.中国卫生检验杂志，199，8(6):346-347.

［10］李小娟，马永建.工作场所空气中硫酸二甲酯的气相色谱快速测定［J］.中国工业医学杂志，2010，23(4):301-302.

［11］覃宣富，邹晓莉，黎源倩，等.气相色谱-电子捕获检测测定环境样品中的硫酸二甲酯含量［J］.四川大学学报(医学版)，2010，41(5):877-880.

［12］段正康，刘平乐，熊 鹰，等.甲胺磷原油中硫酸二甲酯的正相高效液相色谱分析［J］.湘潭大学自然科学学报，1999，21(3):40-41.

［13］国家技术监督局.GB/T 17077-1997车间空气中硫酸二甲酯的溶剂解吸液相色谱测定方法［S］.北京:中国标准出版社，2004.

［14］张淑琴，聂 莉.车间空气中硫酸二甲酯的高效液相色谱测定方法［J］.卫生研究，1992，21(2):73-75.