KKAI1／CD82在甲状腺癌中的表达及临床意义

田忠成，邵飞飞，党雪菲 ，邱 实

（吉化集团公司总医院 化疗科，吉林 吉林132021）

甲状腺癌为较常见的恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤1%，严重威胁着人类的健康。甲状腺癌是多因素起源的癌基因和抑癌基因相互失衡导致的疾病。由于甲状腺肿瘤病程隐匿、进展缓慢，一般良、恶性肿瘤的症状和体征也没有明显的区别，给临床诊断治疗带了极大的困难。近年来，国内外研究者研究发现KAI1／CD82与肿瘤进程之间密切相关，可视为新的肿瘤标志物。目前KAI1／CD82在甲状腺癌中的表达相关性研究尚无文献报道。

1 材料与方法

1.1 标本选取吉化集团公司总医院2011－2013年甲状腺癌手术切除标本35例：按组织学分型随机选取乳头状腺癌（PTC）10例，滤泡状癌（FTC）13例，髓样癌（MTC）12例，另选正常甲状腺组织12例。患者术前均未行放疗或化疗。收集的所有组织均分成两份，一部分放入10%中性福尔马林，常温下固定用于免疫组织化学染色实验，一部分保存与－80℃冰箱中，用于组织匀浆后进行RT－PCR检测。

1.2 试剂与引物 免疫组织化学染色 免疫组化采用SP法。抗KAI1／CD82人单克隆抗体购自Neo marker公司，S－P二抗试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化 石蜡切片经脱蜡和梯度复水后，将切片置枸橼酸盐修复液中加热至98℃进行修复；冷却至40℃以下，滴加3%H2O2室灭活内源性过氧化物酶的活性，用PBS冲洗；滴加正常兔血清封闭液，室温孵育30min，甩去多余的液体（勿洗）；滴加鼠抗人KAI1／CD82单克隆抗体，4℃过夜，PBS冲洗；滴加二抗，室温孵育20min，PBS冲洗；滴加三抗，室温孵育20min，PBS冲洗；3，3－二氨基苯联胺（DAB）显色；苏木素复染；梯度乙醇脱水、二甲苯透明，树胶封片。用已知KAI1／CD82阳性的甲状腺癌切片作阳性对照，结果为阳性。用己知KAI1／CD82阴性的乳腺癌切片作阴性对照，结果为阴性。用PBS液代替一抗体作空白对照，结果为阴性。

1.3.2 RT－PCR 按 Trizol试剂操作说明提取RNA，逆转录反应按照RT反应试剂盒说明书进行。KAI1／CD82引物：扩增片段长度274bp，上游引物：5’－TGGACTTCTACCTGCCCTCA－3’，下游引物：5’－ACACCATTCTCCTGCCTCA－3’，取PCR反应液10μl进行琼脂糖凝胶电泳，利用1D KODAK凝胶图像分析系统摄片。

1.4 结果判定

1.4.1 免疫组织化学 KAI1／CD82的阳性信号主要定位于细胞膜，阳性表达表现为黄色或棕黄色颗粒，胞浆中亦有着色。200倍显微镜下每张切片计数5个不同视野，计数每个视野中癌细胞总数及阳性癌细胞数。结果用平均数±标准差（±s）表示。①染色强度：0分为无色；1分为黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。②阳性细胞的百分比：1分为阳性细胞≤10%；2分为11%－50%；3分为51%－75%；4分为＞76%。染色强度与阳性细胞所占百分比的乘积上述2项结果相乘：0分为阴性（－），1－2分为弱阳性（＋），3－6分为中等阳性（＋＋），＞6分为强阳性（＋＋＋）。

1.4.2 RT－PCR阳性条带判定方法 与 Marker相比较在274bp和616bp处出现阳性条带者分别判定为KAI1／CD82和GAPDH mRNA阳性表达；如在对应区域未见阳性条带出现，则判定为阴性。用内参照（GAPDH）光密度值标化KAI1／CD82mRNA的吸光度值，得到KAI1／CD82mRNA表达的相对含量。具体计算公式如下：KAI1／CD82相对含量＝（KAI1／CD82光密度值／GAPDH光密度值）×100。

1.5 统计学处理

所有实验数据用SPSS16.0统计软件进行处理，各组间数据比较采用t检验或χ2检验。计量数据以±s表示。RT－PCR结果以1DKODAK凝胶图像分析系统检测灰度值，进行半定量分析，判断差异显著性，P＜0.05差异有显著性，P＜0.01差异有非常显著性意义，P＞0.05差异无统计学意义。

2 结果

2.1 SP法免疫组织化学染色结果显示，在10例甲状腺乳头状癌中，8例表达阳性，阳性率为80%。在13例甲状腺滤泡癌中，7例表达阳性，阳性率53.8%。在12例髓样癌中，2例表达阳性，阳性率为16.7%。而12例正常甲状腺组织中，12例均表达阳性，阳性率为100%。根据阳性结果判断标准，KAI1／CD82在不同组织学分型的甲状腺癌中表达强度不一样。统计结果显示，KAI1／CD82在正常甲状腺组织中与乳头状甲状腺癌中的表达相比有所下降但差异不明显（P＞0.05）。滤泡癌及髓样癌同正常甲状腺组织相比，KAI1／CD82表达显著降低（P＜0.05）。在甲状腺癌中，不同组织学类型的表达具有差异，随着其组织学恶性度的增强，KAI1／CD82表达降低（表1）。

表1 KAI1／CD82在正常甲状腺及甲状腺癌中的表达及其与组织学分型的关系

2.2 RT－PCR检测 KAI1／CD82基因RT－PCR目的片段长度为274bp。电泳结果显示，KAI1／CD82基因在所有检测的甲状腺癌及正常甲状腺癌中具有不同程度的表达，在274bp处出现亮带（图1）。利用Kodak凝胶成像系统软件分析各条带灰度值，并计算目的条带亮度相对值。统计结果显示KAI1／CD82基因在甲状腺乳头状癌中的相对表达值为85.406±12.992，在滤泡癌中的相对表达值为70.1±10.880，在髓样癌中的相对表达值为30.682±13.270，而在正常甲状腺组织中的相对表达值为91.124±12.292。乳头状癌与正常甲状腺组织相比，KAI1／CD82的表达量有所下降，但不显著。滤泡癌及髓样癌同正常甲状腺组织相比，KAI1／CD82表达量显著下降（P＜0.05）。随着甲状腺癌组织学恶性度的提高，KAI1／CD82基因表达水平呈下降趋势（图2）。

图1 KAI1／CD82mRNA在正常甲状腺和甲状腺癌组织中的表达

图2 KAI1／CD82mRNA在正常甲状腺和甲状腺癌组织中的表达

3 讨论

肿瘤的侵袭、转移是肿瘤患者死亡的主要原因。转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是影响患者生命和治疗效果的主要原因。有关转移分子机制的研究表明，这一个多阶段复杂过程的每一阶段都受着不同因素的影响及相关基因的调控。它们或被激活、或被抑制、相互协同或拮抗，最终影响肿瘤细胞的生物学特性。如癌基因的过度活化、抑癌基因的失活；肿瘤细胞增殖周期的调控；肿瘤细胞凋亡的调控、肿瘤转移相关因素的调控等等。因此，探讨与肿瘤生物学相关的因素，寻找肿瘤预防和治疗的有效途径，是目前肿瘤研究的一项重要课题。

3.1 KAI1／CD82的结构和功能

KAI1／CD82是1995年Dong等从人前列腺癌杂交细胞中克隆分离出来的新的肿瘤转移抑制基因，属于 TM4SF（transmembrane4superfamily）家族成员，能与多种转录因子结合，调节基因转录，影响细胞间及细胞与细胞外基质的信号传导，参与细胞的增生调节[1]。KAI1／CD82基因位于人染色体11P11.2上，该基因全长约80kb，含8kb的5’区域、10个外显子、9个内含子和外显子10之后的8kb的DNA序列。编码区在外显子3－10之间，其编码的蛋白质是CD82。大量实验结果表明，KAI1／CD82是一个肿瘤转移抑制基因。KAI1／CD82在细胞上可与各种整合素分子、表皮生长因子受体组成复合体，通过多种信号传导通路来介导细胞的黏附，使肿瘤细胞不易脱离原发灶而起抑制转移功能，同时对肿瘤细胞的迁移和在转移部位的增殖有抑制作用，从而实现抑制肿瘤细胞转移和侵袭。

3.2 KAI1／CD82的肿瘤抑制作用

Tomoyuki[2]研究发现将抑癌基因与肿瘤转移抑制基因联系起来。研究结果表明p53通过与该区域结合从而激活KAI1基因的表达。由于p53失活在许多肿瘤中存在，常会减少p53的转录目的基因KAI1的表达。Mashimo[3]研究组从基因启动子人手，分析了p53和KAI1／CD82基因表达的关系，发现了p53对KAI1／CD82基因表达的正调控作用，同时有效证实了前列腺癌KAI1／CD82阳性和p53阳性存在的一致性。Tsutomu等[4]发现，肿瘤坏死因子－á（TNF－á）通过核因子－JcB（Nuclearfactor，NFJcB）介导能促进KAI1／CEt32的表达，提示KAI1／CD82的表达可能与宿主肿瘤的微环境有关。Dong等[5]的研究表明，KAI1／CD82蛋白的、上皮细胞膜定位和广泛的糖基化，提示KAI1／CD82蛋白参与细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的反应，KAI1／CD82蛋白对肿瘤转移的抑制作用可能与其可调节细胞的粘附作用有关。在正常前列腺组织及良性增生组织中CD82分子表现为高表达，且定位于浆膜上间质成分不表达。

3.3 KAI1／CD82的转移抑制作用与肿瘤

KAI1／CD8在人体的许多组织中表达，在对食管癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等患者的研究过程中，发现KAI1／CD82的表达和肿瘤的转移密切相关。大多数肿瘤细胞中KAI1／CD82表达下降提示肿瘤转移的机率增加。Dong等[1]发现KAI1／CD82在正常前列腺高表达，转移性人前列腺癌细胞株中表达降低或不表达，认为KAI1／CD82的过表达可能限制早期前列腺癌的发展，而它的丢失可能使肿瘤更具有侵袭行为，改变KAI1／CD82的表达在前列腺癌和与癌相关的前列腺增生中有改善预后的重要作用。董良鹏等[6]采用免疫组织化学方法检测20例成人正常贲门黏膜正常组和51例贲门癌组织中KAI1／CD82蛋白表达的阳性率，结果发现KAI1／CD82蛋白在贲门癌组织的表达与肿瘤的临床分期浸润深度和淋巴结转移有关联，KAI1／CD82在贲门癌组组织中的表达可作为从分子水平判定人贲门癌组恶性生物学行为的指标。季润元等[7]应用组织芯片和免疫组织化学技术检测233例结直肠癌组织中KAI1／CD82的表达，结果发现KAI1／CD82在结直肠癌组织中的表达缺失与肿瘤的分化程度分期密切相关，有望成为判断结直肠癌预后的新标志。汪庚明等[8]应用PCR法检测5种人鼻咽癌细胞株、28例鼻咽癌和15例非肿瘤性鼻咽部组织KAI1／CD82mRNA的表达情况，结果发现KAI1／CD82基因在低转移性人鼻咽癌细胞株中高表达，而在高转移性人鼻咽癌细胞株中低表达。KAI1／CD82基因在鼻咽癌组织中低表达，在非肿瘤性鼻咽部组织中高表达，提示该基因在鼻咽癌的发生、发展中可能起到一定作用。KAI1／CD82基因在鼻咽癌组织的低表达与鼻咽部淋巴结转移有关，提示该基因在抑制鼻咽癌转移的过程中起重要作用。武世伍等[9]采用免疫组化ElivisionTMplus法和特殊组织化学法检测160例NSCLC和20例正常肺组织中CD82／KAI1的表达情况。结果在正常肺组中CD82／KAI1的表达率明显高于NSCLC组织；其水平与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移、临床分期和术后生存期有关；Kaplan－Meier生存分析表明CD82／KAI1阳性表达的患者生存率明显高于阴性者。Yu等[10]报道KAI1／CD82与膀胱癌的预后有关，他们发现15例KAI1／CD82阳性患者的总生存率明显高于25例KAI1／CD82阴性患者。Mashimo等[11]研究了KAI1与p53的关系，也观察了前列腺癌患者的生存率，发现这两个标志物缺失使得患者的生存期显著缩短。

3.4 KAI1／CD82的转移抑制作用与甲状腺癌

Chen等[12]用 RT－PCR和免疫组化法研究75例甲状腺癌患者，发现甲状腺癌组织中的KAI1／CD82表达比良性甲状腺组织中的表达水平显著下降，转移性瘤组织中KAI1／CD82的表达比非转移性瘤组织中的KAI1／CD82的表达水平显著下降，KAI1／CD82表达与肿瘤病理分级、临床分期呈负相关。本实验中，我们利用免疫组织化学技术和RTPCR技术检测了正常甲状腺组织和不同组织学类型的甲状腺癌组织中KAI1／CD82蛋白及mRNA的表达水平。在正常甲状腺中，KAI1／CD82具有很高的表达水平。在甲状腺癌中的表达水平较正常甲状腺降低，并随着其恶性度的增高而显著降低。KAI1／CD82在恶性度最高的髓样癌中，免疫组化法几乎检测不到KAI1／CD82的表达，提示KAI1／CD82在甲状腺癌进展中的重要作用。综合我们的实验结果，我们认为KAI1／CD82在正常甲状腺中呈阳性表达，在恶性度高的甲状腺癌中的表达水平显著低于正常甲状腺组织并随甲状腺癌的组织学恶性度增加而降低。检测KAI1／CD82在甲状腺癌中的表达情况对甲状腺癌的临床诊断治疗具有一定指导作用和意义，可能成为患者预后推测的重要指标。

[1]Dong JT，Lamb PW，Rinker CW，et al.KAI1，a metastasissuppressor gene for prostate cancer on human chromosome11p11.2[J].Science，1995，268：884.

[2]Tomoyuki M，Misako W，Shigeru H，et al.The expression of KAI1gene，a tumor metastasis suppressor，is directly activated by P53[J].Science，1995，268：884.

[3]Mashimo T，Watabe M，Hirota S，et al.The expression of the KAI1gene，a tumor metastasis suppressor，is directly activated by P53[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（19）：1130.

[4]Tsutomu S，Naoki N，Masaki H.Transduction of KA11／CD82cDNA promotes hematogenous spread of human lung cancer cells in natural killer cell－depleted SCID mice[J].Cancer，2001，94：238.

[5]Dong JT，Suzuki H，Pin SS，et al.Down－regulation of the KAI1 metastsissuppressor gene during the progression of human prostatic cancer infre quently involves gene mutation or allelic loss[J].Cancer Res，1996，56（19）：4387.

[6]董良鹏，陈玲云，秦 双.P33IG1b和KA11／CD82在贲门癌组织中的表达及其意义[J].吉林大学学报（医学版），2013，39（3）：544.

[7]季润元，史恩溢，王永实，等.结直肠癌中KAI1／C D 82的表达及其与临床病理的联系[J].重庆医科大学学报，2013，38（1）：33.

[8]汪庚明，郭 卿，徐洪波，等.探讨KAI1／CD82基因在鼻咽肿瘤中的意义[J].中华全科医学，2012，10（4）：502.

[9]武世武，承泽农，俞 岚，等.CD82／KAI1和 HIF－1a在非小细胞肺癌中的表达及其与血管生成拟态的关系[J].中国肺癌杂志，2011，14（12）：918.

[10]Yu Y，Yang JL，Markovic B，et al.Loss of KAI1messenger RNA expression on both high－grade and invasive human bladder cancers[J].Clin Cancer Res，1997，3（7）：1045.

[11]Mashimo T，Bandyopadhyay S，Goodarzi G，et al.Activation of the tumor metastasis suppressor gene KAI1，by etoposide ismediated by p53and c－Jun genes[J].Biochem Biophys Res Commun，2000；274：370.

[12]Chen Z，Mustafa T，Trojanowicz B，et al.CD82and CD63in thyroid cancer[J].Mol Med，2004，14：517.