苦瓜叶萃取物对亚洲玉米螟代谢酶活性的影响

朱春亚，刘 欢，曹 溪，张茂新，凌 冰

(华南农业大学昆虫生态研究室，广州 510642)

苦瓜Momordica charantia L.属于葫芦科植物，广泛分布于热带非洲和亚洲(Grover et al.，2004;Subratty et al.，2005)，是一种常见蔬菜，因其全株包括果实味极苦而得名。与其他葫芦科植物相比，苦瓜的生长更少受到虫害的为害。大量研究证实，苦瓜叶片中含有丰富的具抗虫活性的次生物质，它们对多种农业害虫有明显的拒食、抑制生长发育作用和毒杀作用(Chandravadana and Pai，1987;Yasui et al.，1998;Abe and Matsuda，2000;李绍勤等，2001;凌冰等，2009;骆颖等，2012)。

但有关苦瓜次生物质对昆虫作用机制的研究却很少。骆颖等测定了苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾幼虫中肠蛋白酶和淀粉酶活性的影响(骆颖等，2012)，而对昆虫其它酶系的影响尚未见报道。藻糖酶可以将昆虫体内的海藻糖水解成葡萄糖而被昆虫利用，在昆虫的能量代谢上扮演着重要角色(王军娥和刘静，2009)。羧酸酯酶、碱性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶是昆虫抵抗外来有毒物质的重要解毒酶系，可参与植食性昆虫对植物次生物质的抗性，对维持昆虫的正常生理代谢起重要作用 (陈长琨，1993;陈凤菊等，2003)。我们研究了苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟 Ostrinia furnacalis(Güenée)幼虫体内上述酶系活性的影响，旨在阐明苦瓜叶片抗虫次生物质的作用机理，为能将其开发为一类新型的具有良好环境和谐性的植物性杀虫剂提供科学依据。同时，对进一步揭示苦瓜抗虫的化学机制有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试药剂与化学试剂

供试药剂是从苦瓜叶乙醇粗提物中用乙酸乙酯萃取获得的膏状物(凌冰等，2008);化学试剂:α-萘酚、α-乙酸萘酯、固蓝盐B、SDS、硫代碘化乙酰胆碱、5，5-二硫基-双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、牛血清蛋白、还原型谷胱甘肽等均为Sigma 公司产品;毒扁豆碱和1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)为BBL 公司产品;对硝基苯基磷酸二钠和对硝基酚为Amresco 公司产品;考马斯亮蓝G250为北京鼎国生物技术有限责任公司产品。

1.2 供试虫源及饲养方法

亚洲玉米螟由中山大学提供，采用陈其津(2000)的饲料配方在室内繁殖3 代。严格挑选发育均一的3 龄幼虫，饥饿4 h，然后分别用添加了不同剂量苦瓜叶乙酸乙酯萃取物的人工饲料饲养72 h。苦瓜叶乙酸乙酯萃取物添加到人工饲料时，先配制成不同浓度的丙酮溶液，当人工饲料冷却至40℃时，按饲料与药液等于5∶1的比例加入人工饲料中充分混匀，对照饲料中亦加入等量的丙酮。

1.3 酶液的制备

幼虫15 头一组放入预冷的玻璃匀浆器中，加入5 mL pH7.0的0.1 mol/L 磷酸缓冲液在冰浴条件下匀浆。匀浆液在4000 r/min、4℃离心10 min，取上清液作酶源，-20℃保存待测。

1.4 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟不同酶活力的影响测定

1.4.1 海藻糖酶活性测定:参照钟国华等(2000)的方法。用0.02 mol/L的PBS 缓冲液(pH5.8)5 mL 提取酶液。取0.25 mL 酶液加入0.5 mL 2 mmol/L海藻糖标准液中混匀，在37℃水浴中培养60 min。取1 mL 反应液，加入3，5-二硝基水杨酸试剂2 mL，混匀，沸水浴加热5 min，冷却后用iMark 酶标仪13601 (伯乐)测定其550 nm处的光密度值(OD)。以考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，根据标准曲线方程计算葡萄糖含量，酶活力以μmol(葡萄糖)/mg (蛋白质)·min 表示。

1.4.2 磷酸酯酶活力测定参照Bessey (1946)的方法。酸性磷酸酯酶活力的测定，取酶液0.2 mL加入到2.3 mL的0.2 mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6)中，再加入0.0075 mol/L 对硝基苯基磷酸二钠0.5 mL，37℃水浴30 min 后加入2.0 mL的0.1 mol/L氢氧化钠溶液混匀，测其400 nm 处的OD 值。碱性磷酸酯酶活力的测定是用0.05 mol/L碳酸缓冲液(pH10.0)代替0.2 mol/L 醋酸缓冲液，其他均与酸性磷酸酯酶测定方法相同。用对-硝基苯酚作标准曲线计算酶活力。

1.4.3 羧酸酯酶活力测定:参照Van Asperene(1962)的方法。取上述10μL 酶液加入3.49 mL 0.04 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)中混匀，再加入0.5 mL 4×10-4mol/L的α-乙酸萘酯液，37℃水浴30 min 后加入0.5 mL 显色剂(0.1%固牢蓝B盐与SDS 溶液按2 ∶5 混合)终止反应，静置10 min，用iMark 酶标仪13601 (伯乐)测定其600 nm 处的光密度值。重复3 次(下同)。以不同浓度的α-萘酚作标准曲线。

1.4.4 谷胱甘肽-S-转移酶活力测定:参照Booth (1961)方法。反应混合液含0.1 mL 酶液，2.9 mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液 (pH8.0)、0.7 mL 0.03 mol/L的谷胱甘肽液和 50μL 0.1 mol/L的CDNB 液，在25℃水浴中反应30 min后加热使其失活，测定350 nm 处OD 值。

1.5 可溶性蛋白含量测定

采用Brandford (1976)法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定可溶性蛋白含量。实验求得标准曲线方程为 Y=0.0693x+0.0044，R2=0.9968。

1.6 实验数据分析

获得的数据采用SAS 9.0 版软件的方差分析(ANOVA)进行统计处理。并用邓肯氏新复极差检验法(Duncan's multiple range test，DMRT)检验不同浓度处理间的差异显著性(P=0.05)。

2 结果与分析

2.1 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶的抑制作用

用含有0.025%-0.4% 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物的饲料饲喂3 龄亚洲玉米螟幼虫，24 h、48 h 和72 h 分别测定其海藻糖酶比活力。图1 显示了不同剂量的苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶活性的影响。结果表明，0.025%-0.4%苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶活力均有明显的抑制作用。随着苦瓜叶乙酸乙酯萃取物浓度的增加，海藻糖酶的比活力逐渐降低，且明显低于对照(24 h:F5，17=25.83，P＜0.0001;48 h:F5，17=101.98，P＜0.0001;72 h:F5，17=71.03，P＜0.0001);随着苦瓜叶乙酸乙酯萃取物处理时间的延长，对海藻糖酶活力的抑制作用也逐渐增强。处理24 h-72 h，0.2%萃取物处理的相对活力(以对照比活力为100%)平均比对照减少了32.3%，0.4%处理的相对活力平均比对照减少了40.8%。

图1 不同浓度苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶的相对活力Fig.1 Changes of trehalas relative activity dependent on dosage of theethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia Furnacalis

2.2 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫磷酸酯酶活性的抑制作用

不同浓度苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶活性的影响见图2。从图2A 可以看出，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟幼虫碱性磷酸酯酶的活性有明显抑制作用。处理24 h、48 h 和72 h，除了低浓度(0.0125%)苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对该酶活力的影响与对照差异不显著外，0.05%以上浓度处理组碱性磷酸酯酶比活力均显著低于对照 (24 h:F5，17=65.68，P＜0.0001;48 h:F5，17=107.58，P＜0.0001;72 h:F5，17=6.05，P=0.0051)。处理24-72 h，0.2%处理的相对活力平均比对照减少了34.1%。

从图2B 可以看出，处理24 h，0.0125%-0.1%苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对酸性磷酸酯酶活力均表现出诱导效应，相对活力比对照高出48%-67%(F5，17=36.29，P＜0.0001)，而高浓度(0.2%)处理的相对活力与对照差异不显著。处理48 h 和72 h，除了低浓度(0.0125%)处理酸性磷酸酯酶活力与对照差异不显著外，0.05%以上的浓度均有明显的抑制作用，酸性磷酸酯酶比活力均显著低于对照(48 h:F5，17=98.11，P＜0.0001;72 h:F5，17=31.87，P＜0.0001)。苦瓜叶乙酸乙酯萃取物处理初期对酸性磷酸酯酶活性的诱导作用可能是虫体对外源物的一种应急反应，随后的被抑制现象可能因为虫体的生理机能下降引起的。

图2 不同浓度苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟磷酸酯酶的相对活力Fig.1 Changes of phosphatase relative specific activity dependent on dosage of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia furnacalis

2.3 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟羧酸酯酶活性的影响

从图3 可以看出，在处理后24 h，0.0125%-0.2%苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对羧酸酯酶活性均有明显的抑制作用，其抑制作用随着苦瓜叶乙酸乙酯萃取物浓度的增加而增强(24 h:F5，17=36.29，P＜0.0001);但48 h，0.0125%-0.1%处理组羧酸酯酶的活性逐渐恢复，与同期对照差异不显著，高浓度(0.2%)处理表现出一定的诱导作用(48 h:F5，17=4.11，P=0.0208)。72 h，各浓度处理羧酸酯酶活性均与同期对照差异不显著(72 h:F5，17=1.52，P=0.2542)。

图3 不同浓度苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟羧酸酯酶的比活力Fig.3 Changes ofcarboxyl esterases specificactivity dependent on dosage of of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia furnacalis

2.4 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

从表1 可以看出，含有低浓度(0.0125%和0.025%)苦瓜叶乙酸乙酯萃取物的饲料饲喂亚洲玉米螟3 龄幼虫24 h 和48 h 后，对其谷胱甘肽-S-转移酶活性没有明显的影响，但用0.05%以上的浓度饲喂对亚洲玉米螟幼虫谷胱甘肽-S-转移酶活性却有明显的诱导作用(24 h:F5，17=17.79，P＜0.0001;48 h:F5，17=20.34，P＜0.0001)。72 h，随着亚洲玉米螟幼虫的不断取食，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物在其体内的积累逐渐增多，对谷胱甘肽-S-转移酶诱导作用亦随着增强，低浓度(0.0125%和0.025%)的处理也表现出明显的诱导作用(72 h:F5，17=73.72，P＜0.0001)。

3 结论与讨论

苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、斜纹夜蛾等害虫具有明显的拒食、胃毒及抑制生长发育和生殖力的作用(凌冰等，2008;骆颖等，2012)，这可能与其对代谢酶活性的影响有关。本研究结果表明，苦瓜乙酸乙酯萃取物可显著抑制亚洲玉米螟幼虫体内海藻糖酶活性，同时，对碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶活性也有明显的抑制作用，且随着苦瓜叶乙酸乙酯萃取物浓度的增加和处理时间的延长其抑制作用逐渐增强。海藻糖酶在昆虫的能量代谢、生长发育及生殖腺和生殖细胞发育等方面起重要作用(Selvisabhanayakam，et al.，1993;钟国华等，2000)。磷酸酯酶(包括碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶)不仅在昆虫体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢中起重要作用，而且对外源化合物的解毒代谢也起着重要作用(徐艳聆等，2007)。昆虫体内海藻糖酶和磷酸酯酶活性受到抑制，将破坏昆虫正常生理功能，导致昆虫生理代谢紊乱，生长发育受阻。因此，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对海藻糖酶和磷酸酯酶活性的抑制作用可能与其毒杀和抑制昆虫生长发育作用有关。另外，本研究结果表明，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对羧酸酯酶活性的影响是随处理时间而变化的，表现为先抑制，后逐步被激活、再恢复的变化过程。周琼等(2011)用环氧苍耳素I 处理菜青虫后，其中肠羧酸酯酶的活性也表现出先抑制后升高的现象。羧酸酯酶是昆虫体内一类重要的解毒酶系，不同植物次生物质对昆虫羧酸酯酶活性的影响是不同的。张爱萍等(2008)报道用0.01-1.0 mg/mL 槲皮素对B 型烟粉虱羧酸酯酶活性有明显的诱导作用，而0.1-0.5 mg/mL的2-十三烷酮和0.75-30.00 mg/mL葫芦素B 则表现出明显的抑制作用，这表明不同植物次生物质对昆虫羧酸酯酶同工酶组成的影响是不同的。苦瓜叶乙酸乙酯萃取物进入亚洲玉米螟体内后先抑制了羧酸酯酶活性，从而抑制了昆虫的正常生理代谢。随着亚洲玉米螟取食时间的延长进入其体内的苦瓜叶乙酸乙酯萃取物浓度不断提高，由于解毒功能的需要，部分羧酸酯酶同工酶被诱导激活。这可能是亚洲玉米螟对外界刺激的一种适应机制。

表1 苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响Table 1 Effect of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves on GSH-S-transferase specific activity in larvae of Ostrinia furnacalis

谷胱甘肽-S-转移酶是昆虫体内重要的解毒代谢酶，对外源化合物的解毒代谢起着重要作用(谢苗和尤民生，2011)。已有的研究表明，植物次生物质可诱导昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的活性(董向丽等，1998;董钧锋等，2002;吕敏等，2012)，可能与昆虫与植物的长期协同进化有关，一方面植物会分泌有毒植物次生物质来抵御昆虫的侵害，另一方面，植食性昆虫为了应对植物的化学防御，其体内的解毒酶系活性同时被诱导，从而增强了昆虫对植物次生物质的解毒作用，使昆虫免受次生物质的影响(Després et al.，2007;Piskorski et al.，2011)。我们的研究结果显示，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对谷胱甘肽-S-转移酶有显著的诱导作用，并表现出明显的剂量效应关系，说明谷胱甘肽-S-转移酶在对苦瓜叶乙酸乙酯萃取物的解毒过程中发挥重要作用。

本研究表明，苦瓜乙酸乙酯萃取物可显著抑制亚洲玉米螟幼虫体内海藻糖酶活性，说明该酶有可能是其的作用靶标之一。鉴于哺乳动物体内不存在内源性的海藻糖，许多科学家认为研究和开发以海藻糖酶为靶标的新型杀虫剂将成为今后的新方向(钟国华等，2000;杨艳等，2005;王军娥和刘静，2009;于彩虹等，2011)。目前，我们已从苦瓜叶乙酸乙酯萃取物中分离得到具有生物活性的momordicin I、momordicin II、3β，7β，25-trihydroxy-cucurbita-5，23-dien-19-al 和3β，7β，25-trihydroxycucurbita-5，23-dien-19-al-3-O-β-D-glucopyranoside 等化合物，有关这些化合物对昆虫海藻糖酶及相关代谢酶的作用机理有待研究。本研究为进一步了解和揭示这些活性物质的作用机制奠定了基础。

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