紫外光谱法研究久效磷与碱基的相互作用

王 丽，刘 飞，桑宏庆

（安徽科技学院 食品药品学院，安徽 凤阳 233100）

久效磷，分子式为C7H14NO5P，学名O，O－二甲基－O－（1－甲基－2－甲基氨基甲酰基）乙烯基磷酸酯，相对分子量为223.16，为乙烯型磷酸酯类杀虫剂，兼具内吸与触杀作用，杀虫谱广，速效性好，残存期长，对鱼类及水生动物有毒，对鸟类和蜜蜂高毒，属于高毒农药［1］。核酸适体（Aptamer）是一种新型的仿生生物识别元素，是通过指数富集的配体系统进化技术从人工体外合成的随机寡核苷酸库中反复筛选得到的能与靶分子特异性结合的单链的DNA或RNA［2－3］。如果能成功筛选久效磷的核酸适体，将为久效磷的检测开拓新的思路。核酸适体筛选的首要步骤是寡核苷酸库的构建，碱基是寡核苷酸的重要组成，从微观入手研究碱基和久效磷的作用，将为核酸适体库的构建及适体的筛选奠定基础。

紫外可见吸收光谱是研究小分子与碱基和DNA相互作用的一种最简便、最常用的技术，小分子与碱基的相互作用会引起特征吸收峰的红移或蓝移现象及增色和减色现象，因此通过吸收峰的变化可以判断碱基和小分子的作用程度［4－5］。童裳伦等［6］通过紫外可见吸收光谱法研究发现百草枯分子通过嵌插方式结合到小牛胸腺DNA的双螺旋结构上。何盈盈等［7］研究发现蒽与DNA碱基胸腺嘧啶以面对面相平行的方式发生了P－P电子给体受体作用。胡兴等［8］研究发现金属离子对DNA－抗蚜威结合的影响程度主要取决于金属离子与DNA碱基和磷酸基团间结合的相对亲和比。张玥等［9］利用紫外光谱法研究了利谷隆与DNA的相互作用，推断利谷隆与DNA可能发生嵌插作用。王丽等［10］曾通过紫外吸收光谱法研究甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果与四种碱基的相互作用，推断了有机磷农药与核酸适体作用的活性位点。本文利用紫外吸收光谱法研究了不同pH值以及Na+、K+和Mg2+浓度条件下，四种碱基对久效磷紫外吸收光谱的影响，旨在了解久效磷与四种碱基的作用程度，为久效磷适体筛选过程中适体库恒定区域的设计和缓冲体系的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

UV－1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司）;AL204电子分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）;PHS－3B pH计（上海雷磁仪器厂）。

久效磷标准品（上海市农药研究所，纯度为97.4%）;腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶为生物试剂，购自上海生工生物技术有限公司;Tris、HCl、NaCl、KCl、MgCl2均为分析纯;实验用水均为超纯水。

1.2 试验设计

首先研究不同 pH 值（分别为 7.0、7.2、7.4、7.6、7.8）条件下，久效磷与四种碱基的作用程度;然后在最适 pH 值条件下，研究 Na+浓度（分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L）、K+浓度（分别为 20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L）、Mg2+浓度（分别为 5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L）对它们的相互作用的影响;最后在最适的pH值、离子强度下，研究久效磷与四种碱基的作用。

1.3 紫外吸收光谱的测定

在不同pH值及离子强度的50 mmol/L Tris缓冲溶液条件下，取两个1cm石英比色皿，向一个比色皿中加入3mL浓度为0.05mmol/L的久效磷溶液，另一个比色皿加入等量缓冲溶液，分别用浓度为5mmol/L的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶四种碱基溶液依次进行滴加，混匀，放置5min，以试剂空白为参比，扫描其200～350nm的紫外吸收光谱，每次滴加体积为10μL，因此可忽略体积效应［11－12］，重复进行4次滴加扫描（即久效磷与碱基摩尔比分别为3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4）记录其特征吸光峰并按下式计算吸光度的变化率。

其中:A3∶0为久效磷与碱基摩尔比为3∶0时的久效磷的吸光度，A3∶4为久效磷与碱基摩尔比为3∶4时的久效磷的吸光度。

2 结果与分析

2.1 pH对久效磷与碱基作用的影响

在各pH条件下，随着四种碱基浓度的增加，久效磷215nm左右的峰有明显红移和减色效应，说明久效磷与碱基发生了不同程度的作用。减色效应可能因为久效磷的π*空轨道与碱基的π轨道发生偶合，使能量降低，导致π－π*跃迁能量减少，偶合后的π*轨道因部分填充电子，使π－π*跃迁几率减小［13］。红移程度及吸光度的变化率如表1所示，由表1可知，pH 7.6时随着腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶浓度的增加，久效磷的特征吸收峰有1～2nm的红移现象，吸光度变化率最大，说明此体系下久效磷与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶的作用最强。而对于胸腺嘧啶，pH 7.8时对久效磷特征吸收峰的影响较大，pH 7.6时次之。综合考虑将pH 7.6定为最适的pH缓冲体系。

表1 pH对久效磷与碱基作用的影响Table 1 Effect of pH on interaction between monocrotophos and bases

2.2 Na+对久效磷与碱基作用的影响

在pH7.6的条件下，改变缓冲液中Na+的浓度，考察Na+对久效磷与碱基作用的影响，结果如表2所示。由表2可知，对于腺嘌呤和胞嘧啶，添加Na+时的吸光度变化率均小于未添加Na+时的吸光度变化率，说明Na+对久效磷与腺嘌呤、胞嘧啶的作用有抑制效应，但Na+对维持核酸适体的二级结构有一定作用，因此添加一定的Na+是必须的。在Na+浓度200 mmol/L时，随着腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶的添加，吸光度的变化率最大，此时它们与久效磷的作用最强，此时鸟嘌呤与久效磷的作用也较强，因此Na+浓度定为200 mmol/L。

表2 Na+对久效磷与碱基作用的影响Table 2 Effect of Na+on interaction between monocrotophos and bases

2.3 K+对久效磷与碱基作用的影响

在pH7.6的条件下，改变缓冲液中K+的浓度，考察K+对久效磷与碱基作用的影响，结果如表3所示。由表3可知，K+对久效磷与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶的作用有抑制作用，但在40 mmol/L时，吸光度的变化率相对较大。20 mmol/L的K+可以促进久效磷与胸腺嘧啶的作用，而在较大浓度时又抑制久效磷与碱基的作用。综合考虑久效磷与四种碱基的作用情况，K+浓度定为40 mmol/L。

表3 K+对久效磷与碱基作用的影响Table 3 Effect of K+on interaction between monocrotophos and bases

2.4 Mg2+对久效磷与碱基作用的影响

在pH7.6的条件下，改变缓冲液中Mg2+的浓度，考察Mg2+对久效磷与碱基作用的影响，结果如表4所示。由表4可知，添加Mg2+时的吸光度变化率均小于未添加Mg2+时的吸光度变化率，说明Mg2+对久效磷与腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶的作用都有较强的抑制作用，但在15 mmol/L时，吸光度的变化率相对较大，此时久效磷与碱基间的作用相对较强，综合考虑将Mg2+浓度定为15 mmol/L。

表4 Mg2+对久效磷与碱基作用的影响Table 4 Effect of Mg2+on interaction between monocrotophos and bases

2.5 混合离子对久效磷与碱基作用的影响

在pH7.6及各离子的最适浓度下，考察混合缓冲溶液中久效磷与碱基作用的强弱。结果发现随着四种碱基的不断滴加，久效磷的特征吸收峰发生减色效应，均出现不同程度的红移现象。滴加腺嘌呤时，久效磷的特征吸收峰红移2nm，吸光度的变化率为2.52%;滴加鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶时，久效磷的特征吸收峰红移1nm，吸光度的变化率分别为1.51%、4.59%、3.23%。因此，四种碱基与久效磷的作用程度大小依次为胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤。因此在构建核酸适体库时，可以适当增加胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例。

3 讨论

研究发现，久效磷和四种碱基的相互作用程度有较大差异，同种碱基在不同缓冲体系的条件下与久效磷的作用程度也不同，可能是久效磷的分子结构中含有P=O，通过P=O键作为H的受体与碱基中的－NH2，－NH提供的H结合形成NH—O键［14］，由于不同碱基结构里的－NH2，－NH基团数量不同致使久效磷与碱基的相互作用程度有较大差异。此外，金属离子对久效磷与碱基结合的影响主要取决于金属离子与碱基结合的类型及强弱，与碱基结合能力越强的金属离子，在竞争反应中能够降低久效磷与碱基的结合［15］，表现出抑制作用。金属离子与碱基结合的稳定性主要取决于离子电荷和半径，所带电荷越高与碱基结合稳定性越强，Mg2+的结合稳定性强于Na+、K+，故Mg2+对久效磷与碱基的抑制作用最明显。又由于K+离子半径大于Na+离子半径，K+的结合稳定性大于Na+，因此，K+对久效磷和碱基的抑制效果更强。

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