大孔树脂层析－酸性氧化铝吸附法制备蛇床子素工艺研究

孙士青，史建国，马耀宏，杨俊慧

(山东省科学院生物研究所，山东济南250014)

蛇床子素(osthole)化学名为甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚，是中药蛇床子(Cnidium monnieri(L.)Cuss.)中含量最高的一种香豆素类有效成分。现代药理研究表明，蛇床子素具有抗高血压、抗心律失常、抗骨质疏松、抗炎以及抗变态反应等功效［1］。

高纯度蛇床子素(质量分数90%以上)的制备是研发一类创新药物的必需物质基础，目前报道的蛇床子素的提取可采用溶剂法、酸碱法、超声法及超临界萃取法等［2－4］。但是，能够在工业生产中实际应用的提取方法主要是采用通用提取装置的溶剂法。超声法、超临界萃取法都需要专用的提取设备，成本高、通用性差且维护保养难度大，难以大规模工业化应用。酸碱法对设备腐蚀性强、环境污染压力大，属于行业限制采用的提取法。分离蛇床子素主要有重结晶法、包结重结晶法以及色谱法等［5－7］，由于蛇床子素特殊的亲酯性使得分离蛇床子素需采用的重结晶溶剂以及色谱洗脱溶剂多为氯仿、苯、甲醇和石油醚等有毒、有害、易燃和易爆试剂［2－3］。如果在药品生产过程中使用以上试剂，不仅对环境安全、人员健康有严重危害，而且有毒试剂在所制备的药品中的残留量也将成为新药审评中难以克服的问题。本文采用大孔树脂层析结合酸性氧化铝吸附法分离蛇床子素，仅用乙醇为提取溶剂，而将经过大孔树脂除去了亲脂性杂质的总香豆素类化合物吸附在酸性氧化铝表面装入索氏提取器中，再用原本对蛇床子素溶解性并不强、不适合作重结晶溶剂的乙酸乙酯连续回流洗脱，突出乙酸乙酯对吸附在酸性氧化铝表面的蛇床子素的选择性洗脱能力，巧妙地将提取装置用于分离操作，从而实现只用乙醇与乙酸乙酯两种低毒又经济的试剂即可方便快捷地制备高纯度蛇床子素，为蛇床子素的工业化开发提供了安全可行的工艺条件。

1 仪器与材料

LC-15高效液相色谱仪(岛津);SPD-15C紫外可见检测器(岛津);蛇床子素对照品由国家药品生物制品检定所提供;蛇床子购自亳州药材市场(供试药材由山东省中医药研究院孙立立研究员鉴定);FL-1大孔吸附树脂(天津欧瑞生物科技有限公司);乙醇、乙酸乙酯、氧化铝均为化学纯。

2 研究方法

2.1 色谱条件

色谱柱:岛津 C-18柱(250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈∶水 =70∶30，检测波长:249 nm，流速:0.8 mL/min，理论塔板数:5 000，进样量:20 μL。

2.2 标准曲线

精密称取蛇床子素对照品加乙醇成100 μg/mL溶液作为对照品溶液，精密量取对照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL分别注入液相色谱仪，以蛇床子素进样量为横坐标，吸收峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=308X+342，R=0.998，表明蛇床子素在0.28～1.10 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3 药材蛇床子中蛇床子素的含量测定

参照《中国药典》药材蛇床子“含量测定”项下要求操作［8］。

2.4 蛇床子素制备

蛇床子药材分成不破碎、破粗粉、破细粉各100 g，分别加入体积分数为75%、85%、95%的乙醇回流提取3次，每次1 h。合并乙醇提取液于68℃减压蒸馏回收乙醇，转水液放置至室温，湿法上样1 kg FL-1大孔树脂层析柱(柱直径8 cm、柱床高度80 cm)。上样后用水洗脱2个柱床、体积分数30%乙醇洗脱2个柱床，体积分数为80%的乙醇洗脱至洗脱液检不出蛇床子素，减压蒸馏回收体积分数为80%的乙醇洗脱液至无乙醇蒸馏液滴出。

取上述蒸除乙醇的蛇床子素水溶液分别拌入中性、酸性、碱性氧化铝50 g，80℃烘干水分粉碎过60目筛，装入滤纸筒置索氏提取器中加乙酸乙酯500 mL浸泡过夜，连续回流洗脱10 h，洗脱液蒸馏回收溶剂至过饱和状态，放置析出白色蛇床子素结晶，经HPLC测定质量分数在95%以上。

蛇床子素得率(%)=(制得蛇床子素总量/药材蛇床子素量)×100%。

制得蛇床子素总量=(产品中蛇床子素测得量/测定称样量)×制得物总量。

2.5 正交试验优化工艺

采用L9(34)正交表考察乙醇浓度、药材粉碎度、氧化铝酸碱性对蛇床子素得率的影响，设计正交试验因素水平表(表1)。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experiment design

3 结果与讨论

3.1 供试蛇床子药材中蛇床子素含量测定结果

3份平行样品测定结果(质量分数)分别为1.21%、1.24%、1.25%，平均含量1.23%，符合《中国药典》“含量不低于1%”的要求。

3.2 正交试验结果

根据表1的设计测定不同影响因素(A、B、C)以及不同水平对应的纯化产品中蛇床子素含量，计算蛇床子素得率(表2)。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2分析知，上述因子影响蛇床子素得率的程度依次为:A＞B＞C，乙醇浓度对蛇床子素提取得率影响最大，最佳工艺组合为A3B2C1，即加入体积分数95%乙醇于粉碎成粗粉的蛇床子中回流提取，提取液回收溶剂转水液上大孔树脂柱，大孔柱体积分数80%乙醇洗脱液回收溶剂后拌酸性氧化铝烘干后，再用乙酸乙酯回流洗脱，乙酸乙酯洗脱液回收溶剂至过饱和状态放置析晶，此工艺蛇床子素得率最高。

乙酸乙酯在连续回流条件下可以选择性地洗脱吸附在酸性氧化铝表面的蛇床子素，洗脱液回收溶剂至过饱和状态后便可析出高纯度蛇床子素，相比重结晶法可以大大减少有机溶剂用量，提高工业化生产过程的安全性、降低生产成本;而与色谱法分离蛇床子素工艺比较，本文方法可以减少操作环节、增加样品处理量和产品中蛇床子素的均一性。

蛇床子素在氧化铝表面的吸附性能与洗脱性能目前未见报道，所以相关基础研究薄弱，氧化铝的粒度、晶型、含水量对蛇床子素吸附与洗脱的影响、结晶母液中的蛇床子素的回收利用等都是下一步研究的重点。

［1］闫俊，宣卫东，卞俊.蛇床子素研究进展［J］.中国药业，2012，21(11):110-112.

［2］曾春萍，贾曼谱，王书华，等.蛇床子素制备方法研究［J］.中草药，2011，42(9):1740-1742.

［3］典灵辉，吴铁，崔燎.蛇床子二氧化碳超临界萃取物中有效成分的含量测定［J］.时珍国医国药，2009，20(4):853-854.

［4］王锐，杨婧，谢国梁，等.超声法联合表面活性剂提取蛇床子中蛇床子素的研究［J］.时珍国医国药，2013，24(3):603-604.

［5］秦路平，张巧艳，陈远平，等.蛇床子素晶体及制备方法:中国，CN200610052269.X［P］.2006-12-13.

［6］王徐强，管文佳.一种蛇床子素的制备方法:中国，CN201010531931.6［P］.2011-02-16.

［7］张学农，贝永燕，王周丽.可溶性蛇床子素包含物、分散片及其制备方法:中国，CN201110289546.X［P］.2012-01-11.

［8］国家药典委员会.中华人民共和国国药典2010年版一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:295.