C－ERBB2和MYC mRNA基因表达水平在乳腺癌诊断的临床应用＊

邓 君，洪 华，传良敏，孙昌瑞

四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科（成都 610072）

乳腺癌是发病率高、易转移的恶性肿瘤［1－2］，本研究采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法，通过扩增乳腺癌相关基因C－ERBB2和核内原癌基因（c－MYC）mRNA，对40例健康体检者、79例乳腺癌、66例良性乳腺疾病和51例其它肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）中CERBB2和MYC mRNA表达情况进行分析，探讨C－ERBB2和MYC mRNA在乳腺癌检测及治疗监测中的应用，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选取2012年1月至2014年1月本院健康女性体检者40例，年龄25～67岁；门诊和住院的不同病种患者共196例，年龄27～71岁，经病理学确诊均为初诊者。其中，66例良性乳腺疾病患者中，纤维瘤36例，脂肪瘤30例，排除患其它肿瘤的可能性；79例乳腺癌中，乳腺单纯癌25例，浸润性导管癌36例，黏液癌11例，不典型髓样癌7例，淋巴结及远处转移46例，无淋巴结转移33例；51例其它肿瘤中，胃癌17例、大肠癌11例、肺癌8例、食道癌10例和卵巢癌5例。所有研究对象均于手术前1周内取晨血5mL。

1.2 细胞分离和总RNA的提取

取静脉血5mL（弃去开始1mL，以防上皮细胞污染），EDTA（1mg／mL）抗凝，生理盐水稀释2～3倍，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，采用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取细胞总RNA。

1.3 RT－PCR引物

采用PE公司Primer Express软件设计C－ERBB2引物序列：正义引物5′－AGCCGCGAGCACCCAA GT－3′，反义引物5′－TTGGTGGGCAGGTAGGTG AGTT－3′；MYC 引物序列：正义引物5′－CCCAGC GAGGA（tc）ATCTGGAAGAA－3′，反义引物 5′－GA GAAGCCGCTCCACAT（ag）CAGTC－3′；β2－actin引物序列：正义引物5′－ACTCCATCAATG AAGTGTGA－3′，反义引物 5′－ACTCCTGCTTG CTGATCCAC－3′，由上海基康生物公司合成。

1.4 β2－actin内对照试剂盒

由美国ABI生物公司生产。

1.5 RT－PCR

1.5.1 cDNA合成 逆转录反应体系（mBI公司）20μL，包括细胞总RNA 1μg，随机引物200ng，RNasin 20U，5×逆转录反应缓冲液4μL，m－mLV反转录酶20U。42℃反应55min。

1.5.2 RT－PCR反应 RNA 鉴定：取适量 RNA溶液，紫外分光光度定量，A260／A280的比值为1.8～2.1，说明RNA提取物的纯度较高，计算所提RNA总的含量。按照RT－PCR试剂盒操作，扩增MYC和β2－actin，PCR反应体系20μL，循环条件：94℃预变性5min，94℃ 40s，60℃ 40s，72℃40s，循环32次，72℃末次延伸5min。阳性对照（乳腺癌细胞系MCF－7cDNA）、阴性对照（人纤维瘤细胞系HT1080）。

1.5.3 PCR产物分析 以DNA marker为分子量标志，1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下自显影，出现特异性条带者为阳性；在DNA marker的指示下，凝胶426bp处出现扩增的单一条带，取目的条带与内参比值为半定量值，分析结果。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0进行统计学分析，计数资料采用χ2检验、Fisher确切概率法，计量资料用方差分析，不符合参数检验的数据采用基于秩的非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血CTCs中C－ERBB2和MYC的表达

外周血CTCs中C－ERBB2和MYC在乳腺癌组和良性乳腺疾病组的表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在乳腺癌组和其它肿瘤组的表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；良性乳腺疾病组和其它肿瘤组的表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.2 C－ERBB2和 MYC在外周血CTCs中表达的灵敏度、特异性和一致率

结果初步显示，联合检测2个基因，其对乳腺癌诊断的特异性、灵敏度和一致率均显著高于单一基因检测（P＜0.01）（表2）。

表1 外周血CTCs中MYC和C－ERBB2的表达结果

表2 C－ERBB2和MYC在外周血CTCs中灵敏度、特异性和一致率（%）

3 讨论

C－ERBB2癌基因定位于17号染色体q21带上，编码相对分子质量为185Kd的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性，与表皮生长因子受体（EGFR）基因具有高度同源性，其蛋白产物与细胞生长密切相关，Her2的异二聚体使EGFR在细胞膜过表达，加速了细胞增殖，导致肿瘤形成和生长加快。c－MYC出现在早期的胚胎发育中，控制着细胞生长、发育、分化和凋亡等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。C－ERBB2和c－MYC的异常表达与乳腺癌早期发生、发展和转移密切相关［3－5］。

外周血CTCS存在于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种上皮细胞恶性肿瘤的外周血中，可判断肿瘤患者是否发生远处转移，有助于预测肿瘤早期复发。此外，CTCs还可以用于判断患者临床分期、无进展生存期、总生存期以及实时监控治疗效果，为调整治疗方案并进行个体化治疗提供依据。目前，主要采用免疫细胞学方法从蛋白质水平进行检测，或采用分子生物学方法从基因水平（DNA和RNA）检测［6－7］。2013年中国批准 Cellsearch全自动检测系统用于转移性乳腺癌外周血中CTCs的检测，由于该仪器及其所用试剂价格昂贵，只有几家大型三甲医院采用Cellsearch进行CTCs检测。

本研究通过全面分析，设计论证了适合于基层医院开展的CTCs检测方法。如同原发性肿瘤一样，CTCs也是多基因、多阶段和多因素作用的结果。采用单一生物标志物作为判断CTCs的指标存在明显不足，而综合应用多个生物标志物作为检测指标可以弥补单一指标的敏感性差或特异性不高的缺点，有效提高其准确率。由于C－ERBB2和MYC均是乳腺癌密切相关的较为重要的基因，也是近年来研究较多的基因，因此，本研究采用RT－PCR联合检测外周血CTCs中C－ERBB2和 MYC基因mRNA的表达，以提高对乳腺癌诊断的特异性。

本研究采用RT－PCR检测了40例健康体检者、79例乳腺癌、66例良性乳腺疾病和51例其它肿瘤患者CTCs中C－ERBB2和MYC mRNA表达情况，结果发现外周血CTCs中C－ERBB2和MYC在乳腺癌组和良性乳腺疾病组的表达率比较，差异均有统计学意义；在乳腺癌组和其它肿瘤组的表达率比较，差异均有统计学意义；而良性乳腺疾病组和其它肿瘤组的表达率比较，差异无统计学意义。另外，C－ERBB2和MYC联合检测，可提高对乳腺癌诊断的灵敏度、特异性和一致率。

综上所述，C－ERBB2和 MYC在外周血CTCs的基因表达水平可有效辅助诊断乳腺癌和判断其疗效，而RT－PCR法具有操作简便、价格便宜等特点，且标本来源容易，是一种值得推荐的实验室诊断方法。

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