甘油磷酸胆碱的层析纯化及其稳定性研究

高志荣，赵艳艳，张洪斌，崔云龙，曹明成

(1.合肥工业大学医院;2.合肥工业大学医学工程学院，安徽合肥 230009;3.合肥创新医药技术有限公司，安徽 合肥 230088)

甘油磷酸胆碱(Glycerophosphatidylcholine，GPC，alpha-GPC)是脂磷脂酰胆碱(PC)分子上的两个脂肪酰基完全被水解掉的产物。药物代谢动力学表明:PC被吸收进入血液循环，分布在各器官，它也是人体内分泌代谢的水溶性小分子物质，能通过血脑屏障，为重要的神经传递质乙酰胆碱(Acetylcholine)的生物合成前体［1－2］。根据“胆碱能损伤假说”［3］，老年痴呆症的发病机制(记忆力、认知障碍等)与神经递质乙酰胆碱水平降低密切相关，如果提高脑内乙酰胆碱水平，可以显著改善老年痴呆患者认识功能损伤的症状。有专利报道了甘油磷酸胆碱和茴拉西坦同时服用，可以治疗阿尔茨海默氏症［4］。临床研究表明:GPC治疗脑缺血性中风［5］、阿尔茨海默氏症［6］、多发性脑梗死型痴呆［7］疗效显著。临床用于改善中毒性肝损伤等保肝作用［8］;同时，GPC 还具有显著的防衰老、降血脂、健脑等多种功效，作为保健品及药物制剂的研究与应用正越来越受到重视。GPC已经在意大利、波兰、韩国、俄罗斯、希腊、智利、巴西等国家上市，可在我国，还处于研发阶段。本试验，采用三氧化二铝脱色法［9］和硅胶柱层析法［10］相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行分离纯化，并采用高效液相色谱法对其在强光照射、高温、高湿等条件下的稳定性进行研究，从而为其生产、包装、贮存、制剂研发等提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器 上海民桥精密科学仪器有限公司SL202N型电子天平;长沙湘仪离心机有限公司TG16－WS台式高速离心机;江苏金坛晶玻实验仪器厂HH－2型恒温水浴锅;美国ALLTECH2000蒸发光散射检测器，配备单岛津液相LC－10ATVP输液泵，六通阀手动进样，浙江大学N2000色谱工作站。

1.2 主要试药 GPC粗品由合肥工业大学医学工程学院实验室酶法生产;GPC对照品从意大利Euticals S.pA公司购买;GPC产品(批号为100301，100302，100303)由本实验室分离纯化制得。无水乙醇、甲醇、二氯甲烷均为天津四友公司生产的分析纯试剂，乙腈为天津四友公司生产的色谱纯试剂，所用水为超纯水机制备的去离子水;三氧化二铝和硅胶粉均为100～200目，由国药集团生产。

2 方法与结果

2.1 甘油磷酸胆碱的层析纯化

2.1.1 三氧化二铝和硅胶粉的预处理 三氧化二铝的预处理:将三氧化二铝平铺在容器中，于250℃的烘箱中烘烤4 h待用;硅胶粉的预处理:将硅胶粉平铺在容器中，于105℃的烘箱中烘烤30 min待用。

2.1.2 三氧化二铝对甘油磷酸胆碱粗品脱色 选择甘油磷酸胆碱与三氧化二铝的质量比为1∶10。在烧杯中称取实验室制备的甘油磷酸胆碱约10 g，加入无水乙醇约100 mL，置于50℃的恒温水浴锅中保温，搅拌，使得甘油磷酸胆碱完全溶解后，加入约100 g经过预处理的三氧化二铝，搅拌脱色2 h，离心分离，除去下层三氧化二铝。将上层溶液蒸发浓缩除去溶剂，得到塑黄色的甘油磷酸胆碱4.2 g。

2.1.3 硅胶柱层析法进一步纯化甘油磷酸胆碱称取约210 g经过预处理的硅胶粉，用甲醇溶胀24 h后，湿法装柱。将经过三氧化二铝脱色的4.2 g甘油磷酸胆碱产品溶于少量乙醇中，小心的加入层析柱内。缓慢的加入洗脱剂(甲醇∶乙醇∶氯仿=60∶35∶15)进行洗脱，分段收集柱下端流出的洗脱液，检测，合并含有甘油磷酸胆碱的洗脱液，蒸发浓缩除去溶剂，得到甘油磷酸胆碱产品。

2.2 甘油磷酸胆碱的含量测定及稳定性研究

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取意大利Euticals S.pA公司的GPC对照品适量，用流动相溶解后，转移至100 mL容量瓶中定容，得到约10 g·L－1的储备液，冰箱保存备用。

2.2.2 色谱条件 浙江大学N2000工作站，色谱柱为 GraceSmart RP C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为60%乙腈—水溶液，流速为 0.7 mL·min－1，柱温为(25±1)℃。检测器为美国Alltech 2000型蒸发光散射检测器，漂移管温度为109℃，载气为空气，气体流速为 3.5 mL·min－1，进样量为 20 μL。

2.2.3 标准曲线的测定 分别精密吸取GPC对照品储备液1、2、3、5、10、20 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用流动相定容后，摇匀。精密量取20 μL进样，记录色谱峰面积。对进样浓度(mg·L－1)和峰面积分别取对数，然后以浓度的对数lnC对甘油磷酸胆碱峰面积的对数Y进行线性回归，求得标准曲线方程为:Y=0.538 1lnC －8.722，R2=0.999，线性范围为100～2 000 mg·L－1。实验结果见图1。

通过图1可以看出，硅胶柱层析后GPC在图谱上表现为单峰。无论是从外观上还是从HPLC谱图上分析，都可以得出结论:通过硅胶柱层析能够得到GPC纯品。

2.2.4 样品含量测定方法 精密称取经过分离纯化的GPC适量，用流动相溶解后，转移至100 mL容量瓶中定容，得到约10 g·L－1的溶液。精密量取该溶液5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀。精密量取20 μL进样，记录色谱峰面积，并采用外标两点对数法计算样品含量。

2.2.5 回收率试验 分别精密吸取对照品储备液3、10 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相定容后，摇匀，作为对照品溶液。精密称取分离纯化的GPC(批号100301)适量，用流动相溶解，分别制成约含GPC 0.4、0.5、0.6 g·L－1的溶液各3 份。精密量取20 μL进样，记录色谱峰面积。采用外标两点对数法计算含量，并求得回收率。

平均回收率为 99.81%;RSD=0.85%(n=9)。测定结果见表1。

表1 回收率实验结果(n=9)

2.2.6 精密度试验 对照品溶液取“2.2.5”项下的对照品溶液。精密称取分离纯化的GPC产品(批号100301)适量，用流动相溶解，制成约含GPC 0.5 g·L－1的溶液。精密量取20 μL进样，进样6次，记录色谱峰面积。采用外标两点对数法计算样品含量，并计算相对标准偏差。结果测得GPC的含量分别为:99.02%、99.67%、100.14%、100.18%、99.28%、99.95%，平均含量为 99.71%，RSD=0.48%(n=6)。

2.2.7 强光照射试验［11］取分离纯化的GPC(批号100301)3份，编号为 100301－1、100301－2、100301－3，分别平铺在培养皿中，使其厚度≤5 mm，置于澄明度测定仪下(光线强度为4 500 LX)10 d，于第5、10天取样，与第0天的含量比较，考察其含量变化。平均含量为99.51%;RSD=0.40%(n=9)，结果表明含量无明显变化，即GPC对光比较稳定。试验结果见表2。

表2 强光照射试验结果%

2.2.8 高温试验 取分离纯化的 GPC(批号100301)3份，编号为100301－1、100301－2、100301－3，分别平铺在培养皿中，使其厚度≤5 mm，在60℃下放置10 d，于第5、10天取样，与第0天的含量比较，考察其含量变化。计算平均含量为99.65%，RSD 为0.42%(n=9)，结果说明含量无明显变化，表明GPC原料药对热比较稳定。试验结果见表3。

表3 高温试验结果

2.2.9 高湿试验［12］取分离纯化的 GPC(批号100301)三份，编号为 100301－1、100301－2、100301－3，分别平铺在培养皿中，使其厚度≤5 mm，在25℃于相对湿度75%条件下放置10 d，于第5、10天取样，与第0天的含量比较，考察其含量变化。试验结果:平均含量为99.30%，RSD为0.47%(n=9)，表明GPC对湿比较稳定。试验结果见表4。

表4 高湿试验结果

2.2.10 加速试验 分别取 GPC(批号为100301、100302、100303)各一份，在密闭器皿中于40℃、相对湿度75%的条件下放置6个月，于第1、2、3、6个月月末取样，与第0个月的含量比较，考察其含量的变化。计算含量平均值为99.61%，RSD为0.57%(n=15)，结果含量无明显变化，表明 GPC比较稳定。试验结果见表5。

表5 加速试验结果

2.2.11 长期试验 分别取 GPC(批号为100301、100302、100303)各一份，在密闭器皿中于25℃，相对湿度60%的条件下放置12个月，于第3、6、9、12个月月末取样，与第0个月的含量比较，考察其含量的变化。平均含量为99.12%，RSD为0.50%(n=15)，即含量无明显变化，表明GPC化学性质和物理性质比较稳定。试验结果见表6。

表6 长期试验结果

2.2.12 重复性试验 取配制5份浓度为0.5 g·L－1的 GPC 供试品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件进行测定，按照上述含量测定方法，测得5份GPC供试品的含量分别为99.83%、100.11%、99.92%、98.57%、99.98%，计算 RSD 为0.63%。结果表明本法测定的重复性良好。

3 讨论

试验结果表明，通过三氧化二铝脱色法和硅胶柱层析法相结合的工艺对甘油磷酸胆碱进行分离纯化，能够得到含量达99.5%以上的产品。该分离纯化工艺简单，可操作性强，适用于工业化生产。采用美国Alltech2000型蒸发光散射检测器，使用高效液相色谱法研究甘油磷酸胆碱的稳定性，根据检测结果，GPC色谱峰的理论塔板数均在3000以上。该方法灵敏、准确、重现性好。通过影响因素试验、加速试验和长期试验考察后，甘油磷酸胆碱的性状没有发生明显改变，且产品的各项指标均符合中国药典2010版的规定，产品的稳定性良好。

实事上，甘油磷酸胆碱在意大利LPB公司上市，临床应用多年，临床效果显著。流行病学调查［13］，我国老年痴呆患者约600万左右，目前尚无特效治疗药物，研发治疗相关疾病新药是当务之急。根据国家FDA新药标准，甘油磷酸胆碱可以做为“只要该活性成分未被批准上市”新药研究开发。有关研究表明，新化学实体研发失败的原因主要归结为以下3个方面:安全性、有效性和经济性［14］。本实验室对以大豆磷脂为原料制备甘油磷酸胆碱进行了深入研究，采用非水相生物催化制备甘油磷酸胆碱［15］，生物催化反应所用试剂毒性小，且有高度专一性，且不改变卵磷脂的天然结构，反应条件温和，该工艺经济、安全、环保，适合工业化生产。

进一步对甘油磷酸胆碱的鉴别和含量测定方法进行了探索，采用化学鉴别法、薄层色谱鉴别法、HPLC鉴别法和红外色谱图鉴别法，能够简便、可靠、真实、有效地对甘油磷酸胆碱进行鉴别。所采用的HPLC－ELSD含量检测法，专属性强、重现性高，可作为三类新药GPC的含量标准控制［16］。

综上所述，本实验室以大豆磷脂为原料，采用科学、先进的酶法制备和纯化GPC的工艺，使产品质量达到申报国家新药的质量标准。在强光照射、高温、高湿等条件下的稳定性研究结果表明，甘油磷酸胆碱的物理性质和化学性质比较稳定，从而为其生产、包装、贮存、制剂研发等提供了科学依据。

［1］ Levillain O，Schmolke M，Guder WG.Influence of dehydratation on glycerophosphorylcholine and choline distribution along the rat nephron［J］.Pflügers Arch-Eur J Physiol，2001，442:218 －222.

［2］ 刘春丽，陈 虹，姜 勇，等.松国菊苷对脑缺血大鼠海马、纹状体胆碱、乙酰胆碱水平的影响［J］.药学学报，2013，48(5):790－793.

［3］ Jann MW.Pharmacology and clinical efficacy of cholinesterase inhibitors［J］.Am J Health Syst Pharm，1998，55(Suppl 2):S22 － S25.

［4］ Dauglas James Phillips，Jupiter.Treatment of neurological conditions by the co-administration of aniracetam and l－alpha－glycerylphosphorylcholine:United States，US2009176740(A1)［P］.2009－07－09.

［5］ Skoromets AA，Kovalchuck VV.Drug rehabilitation in stroke patients［J］.Zhurnal NevrologII I PsikhiatrII Imeni S S Korsakova-Jun，2007，107(2):21 －24.

［6］ De Jesus Moreno M.Cognitive improvement in mild to moderate Alzheimer’s dementia after treatment with the acetycholine precursor choline alfoscerate:a multicenter double-blind randomized placebo － controlled trial［J］.Clin Ther，2003，25(1):178 －193.

［7］ Frattola L.Multicenter clinical comparison of the effects of choline alfoscerate and cytidine diphosphocholine in the treatment of multi－ infarct dementia［J］.Current Therapeutic Research，1991，49(4):683－693.

［8］ 陈新谦，金有豫，汤 光.新编药物学［M］.17版.北京:人民卫生出版社，2011:514.

［9］ 曹 栋，裘爱泳，王兴国，等.三氧化二铝柱层析法分离大豆磷中磷脂酞胆碱的研究［J］.中国油脂，2001，26(6):51 －53.

［10］ 李 卫，邵友元，黄光斗.柱层析法分离卵磷脂和脑磷脂［J］.湖北工学院学报，2001，16(2):63 －65.

［11］ 国家药典委员会.中国药典:二部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录199.

［12］ 成海平，高建青，霍秀敏.影响因素试验在药物研发中的作用及其关注点［J］.中国药学杂志，2008，43(2):158 －160.

［13］ 胡祥炬，黄河浪.老年痴呆研究现状及其防治展望［J］.中国老年学杂志，2005，25(10):1276 －1278.

［14］ 高 丽，刘艾林，杜冠华.新分子实体与新药研发［J］.中国药学杂志，2012，47(21):1770 －1772.

［15］ 毛慧芳，张洪斌，赵艳艳，等.非水相生物催化制备甘油磷酸胆碱［J］.食品科学，2012，33(22):67 －71.

［16］ 赵艳艳，张洪斌，毛慧芳，等.甘油磷酸胆碱的鉴别与含量测定［J］.安徽医药，2012，16(5):601 －603.