宫颈癌细胞系中干细胞球样细胞的筛选与鉴定研究△

张颖常亚楠刘欢段华向阳钱海利#

都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京100006

国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021

国医学科学院北京协和医学院北京协和医院妇产科，北京100071

宫颈癌的发病率在全球女性罹患的恶性肿瘤中位居第二，每年新发病例逾50万；虽然放疗与化疗等治疗手段在不断进步，但全球每年仍有20余万患者死于该病[1]。宫颈癌已成为病死率增长最快的肿瘤之一，而复发与转移是宫颈癌患者死亡的最主要原因。

肿瘤干细胞被认为是肿瘤转移及复发的根源[2-3]，所以，根除宫颈癌的关键是消除宫颈癌干细胞。目前对宫颈癌干细胞的研究尚处于起步阶段，如何能有效地分离筛选出肿瘤干细胞是当前的研究热点。本研究拟探讨无血清悬浮培养法分离培养宫颈癌干细胞的可行性，并观察其体外生物学的特性。

1 材料

1.1 细胞系

人宫颈癌细胞系CaSki，由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室保存。

1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）及成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor-basic，bFGF）购于Gibco公司，胰岛素购于Wako公司，Accutase酶购于 Millipore公司，抗 SOX2、抗 OCT4、抗 bcatenin、抗ABCG2、抗actin抗体购于Abcam公司。rhDMEM/F12培养基中添加10 ng/ml的 β FGF、20 ng/ml的 EGF、25 mg/ml的胰岛素、4 mg/ml的FBS等配制成干细胞培养基（stem cells medium，SCM）。

1.3 主要仪器

蛋白印记法电泳仪及转膜系统均购于Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 宫颈癌干细胞球的培养与传代

用胰蛋白酶消化并收集生长密度达90%的Ishikawa细胞，PBS清洗一遍后用SCM重悬，计数；然后接种于Corning超低黏附6孔板中，细胞浓度为1000/ml。培养7～9天后，将肿瘤细胞球收集在15 ml离心管中，自然沉降10 min后吸弃上清以去除细胞碎片；PBS清洗一遍后，加入Accutase酶放入培养箱内消化5～10 min，期间间断性地轻轻吹打；消化后加入SCM继续以1000/ml黏附传代于超低黏附板。

2.2 诱导肿瘤干细胞球分化

收集生长至5～6天的第1代细胞球，吸弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基后置于孵箱培养，每天观察细胞球生长形态，在倒置显微镜下拍照。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期

分别收集第1代细胞球及亲本细胞，用预冷的PBS清洗两次后将细胞重悬于预冷的70%乙醇中，－20℃固定；离心收集固定后的细胞并用PBS清洗两次后加入含RNA酶的PI染料，置于4℃，避光孵育30 min后上机检测细胞周期。

2.4 细胞表面分子标志物检测

2.4.1 蛋白印记法检测细胞表面标志物 收集第1代干细胞球样细胞进行裂解、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜至硝酸纤维素膜做蛋白印记法检测，以亲本细胞为对照，测定干细胞的标志物CK17、CD44和ABCG2的表达情况。

2.4.2 细胞表面标志物的免疫荧光检测 亲本细胞过夜爬片，第1代干细胞球则使用多聚赖氨酸处理的玻片进行爬片。细胞爬片后培养箱放置2 h，PBS洗涤后用多聚甲醛固定，然后再加入0.25%的Tritonx-100室温处理10 min。根据蛋白印记法对细胞表面标志物的检测结果，加入细胞高表达标志物的荧光素标记抗体置4℃下孵育过夜，再加入二抗后室温孵育1 h，PBST洗涤后DAPI封片，最后在显微镜下观察。

2.4.3 细胞表面标志物的流式细胞检测 收集亲本细胞及第1代细胞球细胞，以鼠抗人单克隆抗体CD44为一抗，以FIFC标记的兔抗鼠IgG为二抗。按照流式细胞仪分选细胞的要求，标记后上机检测细胞表面标志物。

2.5 蛋白印记法检测细胞干性相关因子的表达

收集亲本细胞及干细胞球样细胞进行裂解、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜至硝酸纤维素膜，检测干细胞相关因子SOX2、OCT4及 βcatenin的表达情况。

3 结果

3.1 宫颈癌干细胞球的形成

将CaSki接种于添加rhEGF和bFGF的无血清DMEM/F12培养基中悬浮培养，第2天可见细胞分裂，有成球的趋势。细胞球逐渐长大，至第7～9天可见折光度好、中间密度高的致密球，计算细胞成球率为0.2%～0.5%（图1）。

图1 CaSKi肿瘤干细胞球的形成

3.2 干细胞球自我更新及分化潜能

收集生长至9天的细胞球，用Accutase酶消化后继续接种在Corning超低黏附板中并添加配好的SCM悬浮培养。与第1代相比，传代培养的第2代及第3代球细胞的生长速度、成球率及细胞形态无明显差别（图2）。

图2 CaSKi肿瘤干细胞球的自我更新能力情况

收集肿瘤细胞球，接种于6孔板中，加入添加10%胎牛血清的DMEM培养基，显微镜下可见细胞球贴壁、伸展的分化过程。分化后的细胞与亲本细胞相比在光镜下的形态无明显差别（图3）。

图3 CaSKi肿瘤干细胞球的分化能力

3.3 流式检测干细胞球样细胞的细胞周期

采用流式细胞仪检测肿瘤干细胞球样细胞及亲本细胞，分别计数1万细胞，采用ModFit软件对结果进行分析、作图。肿瘤干细胞球样细胞及亲本细胞G0/G1期细胞比例分别为51.0%和38.1%（图4），这表明肿瘤干细胞球样细胞更倾向处于静息期。

图4 CaSKi肿瘤干细胞球样细胞周期

3.4 干细胞球样细胞表面的分子标志

蛋白印记法检测亲本细胞及第1代细胞球中CK17、CD44和ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）的表达情况。结果显示，CD44在亲本细胞中表达量最低，而在干细胞球样细胞中明显高表达（图5）；细胞免疫荧光染色显示在干细胞球样细胞中CD44的表达明显增高（图6）；流式细胞术检测干细胞球样细胞中CD44＋细胞所占的比例为14.7%，明显高于其在亲本细胞中的表达比例（0.3%）。在CaSki形成的肿瘤干细胞球样细胞中，CK17和ABCG2的表达未见明显改变。

图5 CaSKi肿瘤干细胞球样细胞表面分子标志的表达

图6 CaSKi肿瘤干细胞球样细胞CD44免疫荧光检测

3.5 蛋白印记法检测干性相关因子的表达

采用蛋白印记法检测了亲本细胞、肿瘤细胞球样细胞中SOX2、OCT4和 β-catenin的表达情况。与亲本细胞相比，肿瘤细胞球样细胞中SOX2、OCT4及 β-catenin的表达明显增高（图7）。

图7 CaSKi肿瘤干细胞球样细胞干性相关因子的表达

4 讨论

越来越多的证据显示，实体肿瘤及肿瘤细胞系中存在肿瘤干细胞；肿瘤干细胞的研究对肿瘤的治疗具有划时代的意义。目前，对宫颈癌干细胞的研究还处于起步阶段，如何建立稳定获得宫颈癌干细胞的方法对深入探讨宫颈癌转移和复发的生物学机制及为未来以干细胞为靶点的宫颈癌治疗提供了基础。

肿瘤干细胞的分离目前主要有四种方法：①利用特异性标志物通过流式细胞仪或免疫磁珠分选，其前提是需要有特异性的干细胞标志物。目前，多种肿瘤干细胞的特异性标志物已被确定，如乳腺癌和胰腺癌以CD44＋、CD24＋为筛选标志物，而脑肿瘤、肺癌、肝癌、结肠癌则多用CD133＋等为标志物[4-5]。在宫颈癌中，探讨较为广泛的标志物为CK17、p63、CD44和ABCG2，但这些标志物的特异性仍未确定，用它们作标志物来分选宫颈癌的价值仍需进一步验证[6-7]。我们对干细胞球样细胞进行表面标志物检测的结果显示，与CK17及ABCG2相比，CD44在宫颈癌干细胞球样细胞中高表达，而在亲本细胞中的表达很弱。有研究亦证实CD44与肿瘤的转移密切相关，可作为筛选宫颈癌干细胞的有价值的标志物[6,8]。②采用不需特异性标记的侧群细胞（side population，SP）分选法。SP细胞具有可以泵出荧光染料Hoechst3342的特性，流式分析仪利用该特性可以将SP细胞分选出来[9-10]。研究表明，SP细胞中高度富集肿瘤干细胞，但SP细胞与肿瘤干细胞并不等同，并且很多细胞系中并未发现SP细胞的存在，所以此方法也具有一定的局限性[11-13]。另外，Hoechst3342荧光染料本身对细胞具有毒性作用，采用此方法分选出的SP细胞和非SP细胞在进行生物学特性的检测时会受到干扰。③基于肿瘤干细胞具有较强的乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）活性，可将特定底物BAAA转化为荧光产物BAA，从而采用流式细胞仪分选出肿瘤干细胞[14]。但ALDH1在不同组织的表达差异较大；当正常组织高水平表达ALDH1时，则不宜将其作为肿瘤干细胞标志物[15]。④无血清悬浮培养法。肿瘤干细胞在添加生长因子的无血清培养基中可悬浮生长，而成熟分化的肿瘤细胞在无血清培养基中因不能贴壁而死亡，从而富集到肿瘤干细胞。目前，研究者们采用此方法已成功富集到脑肿瘤干细胞、黑色素瘤干细胞、骨肉瘤干细胞及肠道肿瘤干细胞等。因其不需要特异性标志物，且操作简便易重复，故用于宫颈癌干细胞初步研究的可行度高[16-17]。

肿瘤干细胞在肿瘤中所占比例极少（0.1%～4%）。我们利用无血清悬浮培养法检测的初步结果显示，在宫颈鳞癌CaSki细胞系中能够形成干细胞球的细胞占总数的0.2～0.5%。

首先，这些细胞具有干细胞的基本特点——具有自我更新能力及分化潜能[18]。我们在体外富集到第1代的肿瘤干细胞球样细胞后对其进行离心、消化、接种，如此循环得到第2代及第3代干细胞球样细胞。通过对三代干细胞球样细胞的成球率、生长速度及光镜下细胞形态对比，发现所富集到的干细胞球样细胞与第1代干细胞球样细胞相似，显示这种方法获得的干细胞球样细胞具有体外自我更新的能力。在干细胞培养基中添加血清，我们发现肿瘤细胞球样细胞贴壁并伸展，5～7天后贴壁的细胞及采用含血清培养基传至第2、3代的细胞形态与亲本细胞在光镜下并无区别。对它们表达的干性相关蛋白进行检测发现：贴壁细胞蛋白表达量明显低于肿瘤细胞球，并与亲本细胞表达量相近。因此我们推断肿瘤细胞球样细胞具有分化潜能。

其次，与正常细胞相比，富集到的肿瘤干细胞球样细胞较多地处于G0/G1期。而细胞处于周期静止或慢周期状态被认为是肿瘤干细胞的重要特性，这也是肿瘤干细胞对放化疗抵抗的机制之一[16]。

最后，这些干细胞球样细胞的干性相关因子高表达。与亲本细胞和再次分化后的细胞相比，干细胞球样细胞的干性相关因子，如SOX2、OCT4及 β-catenin表达明显增高，而这些干性相关因子是维持干细胞的干性状态所必需的，是维持干细胞分化能力的关键蛋白[19-20]。所以，在以无血清培养基悬浮培养法富集的细胞中，干性相关因子高表达从分子生物学水平显示了细胞具有干细胞的特性。

综上所述，我们采用的无血清培养基悬浮培养法可以有效地富集到宫颈癌干细胞球样细胞，其技术简便，实验重复性好；富集到的宫颈癌干细胞球样细胞具有与肿瘤干细胞相似的特性。宫颈癌干细胞球样细胞的成功富集为我们研究肿瘤干细胞在宫颈癌的发生发展、复发转移的机制及以肿瘤干细胞为目标的靶向治疗奠定了基础，具有较高的探索价值和对其他肿瘤干细胞研究的参考意义。

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