光谱联合电泳法研究双酚A与肿瘤相关DNA的相互作用*

李莉，鲁嘉，李卉卉，杨小弟

(1.江苏大学分析测试中心，江苏镇江 212013；2.安徽中医药大学药学院，合肥 230000；3.江苏省生物医药功能材料协同创新中心，江苏省新型动力电池重点实验室，江苏省生物功能材料重点实验室，南京师范大学化学与材料科学学院，南京 210097)

双酚A(BPA)是一种已知的环境内分泌干扰物，是重要的化工原料，主要用于生产增塑剂、阻燃剂等精细化工产品，其应用涉及食品包装到医疗器械等，由于其应用广泛，对人类的危害不容忽视［1］。

肿瘤的产生通常源于人体内癌基因或肿瘤抑制基因的异常表达。C-myc基因［2］是基础研究中涉及最广泛的癌基因之一，在多种人类肿瘤中都存在异常表达现象；p53基因［3–4］是人类最主要的肿瘤抑制基因，能阻止多种肿瘤生长，其自身结构的改变是其抑癌功能丧失的主要原因。尚未见研究这两种DNA关键片段与一些环境内分泌干扰物间作用机制的报道。

笔者通过多种光谱方法和凝胶电泳技术研究BPA与两种人类肿瘤相关DNA的相互作用，旨在从分子水平上考察BPA与此类DNA分子间的作用机制，也为从化学生物学角度研究肿瘤与环境内分泌干扰物间的关系奠定理论基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电导率／离子综合测试仪：SevenMulti pH型，瑞士Mettler Toledo公司；

低温恒温槽：DC–1006型，中国宁波新芝生物技术有限公司；

数显式恒温水浴锅：HH–2型，中国常州国华电器有限公司；

紫外分光光度计：Cary-5000型，美国Varian公司；

荧光光度计：LS50B 型，美国Perkin Elmer公司；

数字式圆二色谱仪：Chirascan型，英国Applied Photophysics公司；

电泳仪：PROTEAN II xi Cell型，美国Bio-Rad公司；

凝胶成像仪：GelDoc-It型，美国UVP公司；

单 链DNA：(1)p53基 因P1启 动 子区(ss1：5’-CCTCCTCCCCAACTCC-3’，ss2：3’-GGAGGAGGGGTTGAGG-5’)，(2)C-myc基因启动子NHE III1元件区(ss1：5’-GGGAGGGTGGGGAAGG-3’，ss2：3’-CCCTCCCACCCCTTCC-5’)，上海生工生物技术有限公司；

溴化乙锭(EB)：纯度大于98%，美国Sigma-Aldrich公司；

双酚A(BPA)标准品：纯度大于99.9%，美国Accu Standard公司；

其它试剂均为分析纯；

实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 双链DNA的制备

等量混合2条互补单链DNA溶液(500 μmol／L)，由室温升至85℃保持10 min退火，缓慢自然冷却至室温(超过4 h)，即得双链DNA溶液［5］。

1.3 实验方法

1.3.1 紫外滴定实验

在DNA 溶液中逐步滴加BPA溶液，使BPA与DNA的摩尔比从0∶1到5∶1，测量DNA溶液紫外吸收光谱的变化。

1.3.2 紫外升温实验

在生理温度37℃下恒温24 h后进行25～90℃程序升温，测量不同温度下DNA及DNA与BPA以摩尔比为1∶1混合后于260 nm波长处吸光度的变化趋势［6］。

1.3.3 荧光滴定实验

在BPA溶液中逐步滴加DNA溶液，使DNA与BPA的摩尔比从0∶1到10∶1，以270 nm为激发波长，测量BPA荧光光谱的变化。

1.3.4 EB–DNA竞争猝灭实验

配制摩尔比为1∶10的EB–DNA混合溶液，逐步滴加BPA溶液，使BPA与DNA的比例从0∶1到20∶1，以480 nm为激发波长，测量EB–DNA体系的荧光变化。

1.3.5 离子强度影响实验

配制摩尔比为1∶10∶100的DNA–EB–NaCl混合溶液，依次滴加BPA溶液，使BPA与DNA的摩尔比从0∶1到20∶1，以480 nm为激发波长，测量DNA–EB–NaCl溶液的荧光变化。

1.3.6 KI猝灭对比实验

在BPA溶液和BPA–DNA的混合溶液中均依次滴加KI溶液，使KI与BPA的摩尔比从0∶1到20∶1，以270 nm为激发波长，测量两种情况下BPA荧光光谱的变化。

1.3.7 圆二色光谱实验

在DNA 溶液中逐步滴加BPA溶液，使BPA与DNA摩尔比从0∶1到20∶1，测量BPA对DNA 圆二色光谱的影响。

1.3.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

现配20%的聚丙烯酰胺胶成型预电泳0.5 h后进行上样，正式电泳12 h后由SYBR Green I染色，经凝胶成像仪拍照观察。

2 结果与讨论

2.1 紫外滴定实验

向DNA溶液中逐步加入BPA溶液，观测DNA在260 nm处特征峰的变化情况，结果见图2。

图2 BPA与DNA混合后溶液的紫外吸收图谱

由图2可知，DNA特征峰出现减色现象，且当BPA浓度较大时，出现了明显的红移现象。若DNA特征峰出现减色和红移现象则表明分子轴向变化即构象变化［7］，这表明BPA与DNA间存在嵌插作用，BPA的类平面结构可插入DNA碱基对之间，因此影响了DNA双螺旋固有结构。

2.2 紫外升温实验

DNA双链在260 nm处有特征吸收峰，当双螺旋结构改变或解链时则会出现增色现象，把处于最高吸光度与最低吸光度的中间值所对应的温度作为解链温度Tm。在相同条件下，测量纯DNA和小分子与DNA混合溶液的解链温度，结果列于表1。

表1 BPA加入前后DNA的解链温度值

由表1中数据看出，当向DNA中加入BPA后，解链温度均上升了，说明BPA分子插入DNA碱基对中使双链碱基之间结构排列紧密，因此更难解链。此外C-myc DNA的温度升高明显是因为C-myc DNA比p53 DNA含有更高含量的G–C序列，更适于嵌插作用的形成。

2.3 荧光滴定实验

BPA分子由于本身固有的类平面结构而具有固有荧光。向BPA溶液中逐步滴加DNA，记录BPA荧光峰强度的变化，实验图谱见图3。

图3 BPA与DNA混合后溶液的荧光光谱

由图3可知，当加入DNA后，谱线峰形略微改变，表明DNA与BPA反应结合成新的化合物，继续加入DNA后谱线出现猝灭现象，证实了DNA与BPA存在相互作用［8］。

2.4 EB–DNA竞争猝灭实验

溴化乙锭(EB)是常见的DNA嵌插剂，纯DNA无明显的荧光现象，而当DNA与EB嵌插时则有强荧光峰，因此EB常被用于研究小分子与DNA嵌插作用的参照物。向DNA–EB混合体系中加入小分子，若使体系荧光猝灭则表明小分子竞争了EB的嵌插作用，即证明小分子与DNA间有嵌插作用［9］。按1.3.4进行实验，记录DNA–EB体系的荧光变化，结果见表2。当BPA与DNA摩尔比达到10∶1时，体系的猝灭程度达到了20%左右，表明BPA与DNA中存在明显的嵌插作用。

2.5 离子强度影响实验

NaCl可用于控制溶液的离子强度，可电离出相当浓度的阴阳离子。DNA链由磷酸骨架构成，表面带有负电荷，因此NaCl溶液中DNA表面可与阳离子发生无特异性的静电结合。按1.3.5进行实验，与上述EB–DNA竞争实验作对比，对比结果列于表2。若与2.4中实验结果出现差异则表明NaCl的存在影响了原有的相互作用，进一步表明小分子和DNA间还存在静电作用［10］。由表2可知，当有NaCl存在时，BPA使DNA–EB体系的猝灭程度明显降低。表明NaCl的存在竞争了BPA与DNA原有的相互作用，即说明BPA与DNA间存在静电作用。

表2 NaCl对BPA与EB–DNA体系作用的影响结果

2.6 KI猝灭对比实验

I–是典型的阴离子猝灭剂，可猝灭荧光物质的固有荧光，也可与小分子–DNA二元体系形成混合体系用于研究DNA与小分子间的相互作用。当小分子与DNA以嵌插或静电作用结合时，I–受碱基对或磷酸骨架的保护，降低原有的荧光猝灭程度，而当DNA与小分子为沟槽作用时，则猝灭程度会升高［11］。图4分别为KI猝灭BPA谱线和p53 DNA和C-myc DNA存在时KI猝灭BPA谱线。

图4 BPA与KI溶液猝灭对比图谱

由图4可知，当DNA存在时猝灭程度明显降低，进一步证明BPA与DNA间为嵌插和静电作用。

2.7 圆二色滴定实验

DNA圆二色光谱是研究其构象变化准确又快速的方法，当药物或毒物与DNA发生各类作用时，在圆二色图谱上会反映出变化。DNA双链在245 nm处的负峰归属于DNA的B型构象，260～280 nm处的正峰归属于碱基堆积作用，若出现正峰上升和负峰降低现象则表明存在嵌插作用。向DNA溶液中逐步滴加BPA溶液，BPA与2种DNA作用图谱见图5。图5中DNA正负峰均出现了一定程度的降低或升高，表明嵌插作用的存在，而BPA使C-myc DNA负峰上升程度更明显，这可能是2种DNA序列差异造成，C-myc DNA比p53 DNA含有更高含量的G–C序列，更适于嵌插作用的形成［12］。

图5 BPA与DNA混合后的圆二色光谱图

2.8 凝胶电泳实验

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)常用于生物大分子的分离和纯化，不同相对分子质量和不同构象的DNA由于迁移率不同在电泳图中表现为不同的条带［13］。图6中1～4泳道分别为16bp的双链p53 DNA片段以及与BPA以不同摩尔比混合溶液的电泳条带。从图6中可看出，随着BPA与DNA摩尔比不断加大，DNA双链条带逐渐变淡且条带迁移率略减小，结合光谱实验结果可推断出一致的实验结论：嵌插作用可改变DNA双链结构，使相对分子质量增大从而减小迁移率，而静电作用可中和DNA磷酸骨架的负电荷从而也能减小迁移率，因此该实验佐证了嵌插和静电作用。

图6 BPA与p53 DNA相互作用的凝胶电泳图谱

3 结论

据相关研究，平面不饱和环结构与生色团碱基侧链可以一起插入DNA碱基对中［14］，BPA符合此类结构。BPA与肿瘤相关DNA的作用为嵌插和静电作用，使紫外实验中DNA呈现减色和红移现象；紫外升温实验中BPA由于嵌插入DNA碱基对中增加了碱基的紧密度从而使解链温度上升；EB竞争实验和圆二色滴定实验均证实了嵌插作用；离子强度对比实验则证实了静电作用；电泳实验佐证了BPA与DNA间的嵌插和静电双重作用使DNA迁移率降低并使DNA双链含量减少。综上所述，BPA与DNA的结合可影响DNA的双螺旋构象，在分子水平上为BPA对人体内肿瘤相关基因的表达影响提供理论基础。

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