Box-Benhnken响应面法优化超声辅助提取大黄鞣质的工艺研究*

张 铂王 兵曹书华王勇强△

（1.天津市环湖医院，天津 300060；2.天津市第一中心医院，天津市急救医学研究所，天津300192）

·研究报告·

Box-Benhnken响应面法优化超声辅助提取大黄鞣质的工艺研究*

张 铂1，2王 兵2曹书华2王勇强2△

（1.天津市环湖医院，天津 300060；2.天津市第一中心医院，天津市急救医学研究所，天津300192）

目的采用Box-Benhnken响应面法优化大黄鞣质的微波提取工艺。方法在单因素试验基础上，选取超声功率、超声时间和料液比3个因素进行Box-Benhnken响应面法试验设计，对其提取工艺参数进行优化。结果由响应面预测模型得出的最优提取条件为：超声功率为480 W，超声时间为25 min，料液比为1∶17.8（w/v），经验证此条件下平均提取率为（12.72±0.25）%（n=3），与理论值较为接近。结论采用Box-Benhnken响应面法建立的大黄鞣质微波提取工艺模型提取率高，并能很好地预测试验结果。

大黄鞣质 超声辅助提取工艺 Box-Benhnken响应面法

大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根和根茎，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、利湿退黄、逐瘀通经等功效。大黄含有多种有效成分，其中鞣质含量多达30%［1-2］。近年来研究表明大黄鞣质具有多种药理作用：抑制生物体内过剩的自由基，降低血清尿素氮等；另外，鞣质还具有收敛作用，内服可用于治疗胃肠道出血、溃疡等症，外用于创伤、灼伤等［3-5］，是大黄治疗作用的重要活性成分。鞣质作为水提取物中的主要成分，潜在的药理活性值得探究。本研究选用热水回流法提取大黄鞣质，并对其制备工艺进行优化，为大黄鞣质的后续研究提供基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

KQ3200型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；TU-1800紫外-可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司）；AB-135S电子天平（梅特勒国际股份有限公司）；HH-S恒温水浴锅 （江苏省金坛市医疗仪器厂）；TDL-5-A高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科仪器有限公司）；ALPHA2-4冷冻干燥机 （德国Marin Christ公司）。

1.2 试剂

大黄（唐古特大黄）购自青海省果洛地区，经鉴定为Rheum palmatum L.的干燥根；鞣酸（E.Merchk，分析纯）；磷钼钨酸试液（生化试剂，南京森贝伽生物科技有限公司）；干酪素（生化试剂，上海万疆生物技术有限公司）；碳酸钠（天津天力化学试剂有限公司）；所有用水均为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

1.3 提取方法

大黄→洗净→60℃烘干→粉碎机粉碎 （过80目筛）→超声波辅助提取→抽滤→滤液定容→除杂→离心→冷冻干燥→测定大黄鞣质含量。准确称取10.0 g已粉碎大黄粉末，分别在不同的超声功率、超声时间和液料比的条件下提取。过滤后冷冻干燥，得粗大黄鞣质。

1.4 线性关系考察

精密称取恒重（80℃干燥2 h）的鞣酸20.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入30%甲醇水溶液溶解，定容、摇匀，即得鞣酸对照品溶液Ⅰ（400 μg/mL）。精密移取鞣酸对照品溶液Ⅰ0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL分别置于20 mL棕色容量瓶中，依次加入30%甲醇水溶液9.5、9.0、8.0、6.0、2.0 mL，然后加0.1 mol/L HAc-NaAc（pH5.0）缓冲液至刻度，摇匀，即得对照品溶液Ⅱ，分别精密移取对照品溶液Ⅱ1.0 mL分别置于10 mL棕色容量瓶中，依次加入磷钼钨酸试液1.0 mL，再加入29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。以相应的试剂为空白，采用分光光度法，在760 nm的波长处测定光密度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为Y=125.29X+0.0216，R= 0.9994。结果表明：鞣质在1.0～16.0 mg/L质量浓度范围内线性关系良好。

1.5 大黄鞣质含量测定［6］

按照“1.3”项下方法提取大黄鞣质，精密称取恒重粗大黄鞣质50 mg置于20 mL棕色容量瓶中加入30%甲醇水溶液5 mL溶解，加入0.1 mol/L HAc-NaAc（pH5.0）缓冲液10 mL，再加入29%碳酸钠溶液稀释至20 mL，混匀，得溶液Ⅲ。精密移取溶液Ⅲ10 mL，置于含干酪素600 mg的棕色容量瓶中，在电磁搅拌器上搅拌1 h，过滤，摇匀，即得溶液Ⅳ。分别移取溶液Ⅲ和Ⅳ各1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，各加入加入磷钼钨酸试液1.0 mL，再用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。于室温放置15 min后，用1 cm比色皿，以蒸馏水作空白对照，在波长760 nm处分别测定吸光度，A1和A2。由两吸光度之差（ΔA）代入回归方程，计算鞣质含量。大黄鞣质提取率（%）=［大黄鞣质含量（g）/原料重量（g）］×100%。

1.6 单因素实验

根据预实验结果，超声提取次数对大黄鞣质提取率没有影响，因此确定提取次数为1次。影响大黄鞣质提取率的主要因素有超声功率、超声时间和液料比和。本研究的超声功率为300、400、500、600、700 W 5个水平，超声时间选取10、20、30、40、50 min 5个水平，料液比选取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（W/V）5种比例，分别进行单因素实验考察。

1.7 响应面分析法试验设计

本研究根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，选取超声功率（X1，w）、超声时间（X2，min）和料液比（X2，W/V）3个影响因素，以大黄鞣质提取率（Y，%）为响应值。根据单因素实验结果，确定超声功率为400、500、600 W，超声时间为20、30、40 min，料液比选取1∶10、1∶15、1∶20（w/v），将每一个自变量的低、中、高实验水平分别以+1、0、-1进行编码，该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为：

其中Y为响应值（大黄鞣质提取率），A0、Ai、Aii、Aij为方程系数，Xi、Xj（I≠j）为自变量编码值。多项式模型方程拟合的性质由确定系数R2表达，其统计学上的显著性由F值检验。试验因素与水平设计见表1，分别进行响应面实验。通过Design Expert 7.0软件对提取工艺进行响应面分析，求出数学模型，得到最佳工艺参数。

表1 响应面分析因素与水平

2 结 果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对大黄鞣质提取率的影响 结果表明，随着超声功率的增加，大黄鞣质提取率有所增加，增加到500 W后平均提取率为12.23%，再提高超声功率，大黄鞣质提取率并未增加。为减少能耗，确定提取功率为500 W较为合适。见图1。

图1 超声功率对大黄鞣质提取率的影响

2.1.2 超声时间对大黄鞣质提取率的影响 结果表明，大黄鞣质提取率随超声时间的增加而升高，超声30 min时大黄鞣质提取率接近最大值，随后随时间的延长，提取率出现微弱降低趋势。提取时间的延长会增加不必要的能耗，导致资源的浪费，因此大黄鞣质提取的最佳超声时间为30 min。见图2。

图2 超声时间对大黄鞣质提取率的影响

2.1.3 料液比对大黄鞣质提取率的影响 实验结果表明，大黄鞣质提取率随料液比的增加而升高，这是因为水溶液的增加可以加大溶剂分子的驱动力。当料液比为1∶15（W/V）后大黄鞣质提取率接近最大值，随后增加幅度减小。为减少能耗，确定大黄鞣质提取的料液比为1∶15（W/V）。见图3。

图3 料液比对大黄鞣质提取率的影响

2.2 响应面优化法结果

2.2.1 响应曲面优化 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计了三因素三水平的响应面分析试验，以超声功率（X1，W）、超声时间（X2，min）和料液比（X3，W/V）为自变量，以大黄鞣质提取率（Y，%）为响应值，试验方案及试验结果见表2，试验重复3次，用以估计试验误差。

利用Design-Expert 7.0软件对大黄鞣质的提取率试验数据进行多元拟合，表3为回归分析结果。从表3的分析结果可知，整体模型的p-Value＜0.05，表明该二次方程模型比较显著，模型的失拟项的P值为0.5217，大于0.05，说明模型选择合适，该模型的R2= 0.9954，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于大黄鞣质提取试验的理论预测。回归方程的各项方差分析结果还表明模型的一次项超声功率，超声时间和料液比都是极显著的（P＜0.01），按照提取率的影响从大到小排序为：超声功率＞料液比＞超声时间；交叉项中的影响都是高度显著的（P＜0.05）。

表2 Box-Behnken实验设计表与效应值

表3 回归方程中系数的显著性检验

图4、图5、图6分别显示了不同交叉因素对大黄鞣质提取率的交互影响趋势图。等高线图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度：圆形表示两因素交互作用不明显，而曲率半径较大的椭圆则表示两因素交互作用显著，并且曲率半径越大，交互作用越显著，即椭圆越扁平，交互作用越显著。在等高线图上，最大的椭圆即最外围的椭圆代表在该圆上取值时，提取率最低，而最小的椭圆则表示在其上面取值时，提取率最高，它们之间的等高线代表提取率逐渐变化。

图4 超声功率与超声时间对大黄鞣质提取率影响的等高线图（A）和响应面图（B）

图5 超声功率与料液比对大黄鞣质提取率影响的等高线图（A）和响应面图（B）

图6 超声时间和料液比对大黄鞣质提取率影响的等高线图（A）和响应面图（B）

图4为料液比为1∶15（W/V）时，超声功率和超声时间对大黄鞣质提取率影响的响应面三维图。由图可知，超声功率和超声时间存在显著性交互，固定料液比时，随着超声功率和超声时间的增加，大黄鞣质的提取率先增加后降低。图5和图6结果与图4类似。

2.2.2 优化提取工艺参数及验证 经过以上对回归模型响应面的三维立体图分析，以大黄鞣质提取率最大值为目标，由响应面预测模型得出的最优提取条件为：超声功率480 W，超声时间25 min，料液比1∶17.8（W/ V）。按照“1.3”项下以优化后的工艺参数提取3批大黄鞣质，并按照“1.5”项下测定大黄鞣质含量，平均提取率为（12.72±0.25）%（n=3），实验观测值与模型预测值偏差为2.58%，可知，实验观察值和模型预测值比较接近，说明模型预测性良好。

3 讨 论

笔者在单因素实验的基础上，应用响应面法优化大黄鞣质的提取工艺。实验结果表明：超声功率、超声时间和料液比对大黄鞣质提取率的影响极显著；超声功率和超声时间、超声功率和料液比、超声时间和料液比之间的交互作用对大黄鞣质提取率的影响极显著，说明超声功率、超声时间和料液比对大黄鞣质的提取率影响不是简单的线性关系，而是存在交互作用。

鞣质为多元酚类化合物，高温条件下会加速鞣质降解［7］，所以本研究在优化工艺过程中严格控制温度。实验表明提取大黄鞣质过程中温度控制在50℃以下不会对鞣质稳定性产生影响。本试验为了较全面地考察鞣质的提取工艺，同时考察了超声功率、超声时间和料液比多个因素对大黄鞣质提取效果的影响。通过Box-Behnken中心组合试验设计实验，优化得到大黄鞣质最优提取工艺，经验证稳定可行，该工艺适合工业化生产，为大黄中鞣质的提取提供了依据。

［1］ 谭鲁珊，赵海平，赵艳玲，等.大黄蒽醌与鞣质对大鼠肝脏的保护和损伤双向作用［J］.中国中西医结合杂志，2014，34（6）：698-673.

［2］ 郭东艳，师延琼，王幸，等.大黄不同炮制品中鞣质含量的测定［J］.现代中医药，2012，32（4）：76-78.

［3］ 黄娟，张庆莲，皮凤娟，等.大黄的药理作用研究进展［J］.中国医院用药评价与分析，2014，14（3）：282-284.

［4］ 孙冰强，祝广斌.生大黄、芒硝参与治疗重症胰腺炎临床研究［J］.中国中医急症，2014，23（6）：1155-1156.

［5］ 张丽丽，张慧英，王黎敏，等.大黄素对肝纤维化大鼠肺损伤的保护作用［J］.中国病理生理杂志，2014，30（2）：291-296.

［6］ 戴万生，赵荣华，陈红波.干酪素法测定大黄鞣质类成分的研究［J］.时珍国医国药，2003，14（6）：324-325.

［7］ 杜瑞莲，杨中林.五倍子中鞣质提取工艺研究［J］.中成药，2008，30（6）：839-841.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technique of Tannins from Rhubarb by Box-Benhnken Response Surface Methodology

ZHANG Bo，WANG Bing，CAO Shuhua，et al. Tianjin Huanhu Hospital ICU，Tianjin 300060，China

Objective：To optimize the tannins from rhubarb ultrasonic-assisted extraction technique using Box-Benhnken response surface methodology.Methods：On the basis of single-factor experiments，the effects of ultrasonic power，ultrasonic time and solid to liquid ratio on the extraction yield of tannins from rhubarb was investigated with a three-factor Box-Benhnken design.Results：By the response surface model to obtain the optimal extraction.Conditions：ultrasonic power was 480 w，ultrasonic time was 25 min，solid to liquid ratio was 1∶17.8（w/v）.The validated experiment showed the yield of tannins from rhubarb was（12.72±0.25）%（n=3）under those conditions，Which was in consistency with the theoretic value.ConclusionUltrasonic-assisted model of tannins from rhubarb established by Box-Benhnken design could precisely predict the experiment results well.

rhubarb tannins；ultrasonic-assisted extraction technique；Box-Benhnken response surface methodology

R289.5

A

1004-745X（2015）04-0579-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.005

2015-01-22）

卫生部临床重点专科建设项目［卫办医政函（2011）873号］

△通信作者（电子邮箱：zhangbdr＠126.com）