磷钼钨酸—干酪素法测定肉桂提取物中鞣质的含量

郭明里　普俊学　李宁　张建文　杨兆祥

【摘 要】 目的：建立肉桂提取物中总鞣质的含量测定方法。方法：采用磷钼钨酸-干酪素比色法，优化实验参数建立分析方法，对3批肉桂提取物进行测定。结果：最优参数为：干酪素加入量400 mg，Na2CO3浓度20%，显色后30min测定。没食子酸在0.0020～0.0120 mg/mL浓度范围内与吸光度呈现良好的线性关系，R2=0.9997。3批肉桂提取物鞣质含量分别为25.58%、28.42%、29.10%。结论：本方法简单、灵敏、稳定，为肉桂提取物的质量控制提供了有效的方法。

【关键词】 肉桂；鞣质；含量测定；质量控制

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2017）03-0045-03

Determination of Tannins in Cinnamon Extracts by Phosphomolybdium Tungstic Acid-casein Colorimetric Analysis

GUO Mingli1，2 PU Junxue2* LI Ning2 ZHANG Jianwen2 YANG Zhaoxiang2

1.Dali University， Dali 671000，China；2.Kunming Pharmaceutical Corporation， Kunming 650100，China

Abstract：Objective To establish a method for the determination of total tannins in cinnamon extracts. Methods The phosphomolybdium tungstic acid-casein colorimetric method was employed， analytical parameters were optimized and the method was applied to the analysis of 3 batches of samples. Results The optimal parameters were as follows： adding amount of casein： 400mg， concentration of Na2CO3 solution： 20%， determination time point： 30 minutes after coloration reaction. Gallic acid was used as the standard compound. The linearity range was 0.0020～0.0120 mg/L， showing good linearity （R2=0.9997）. The contents of total tannins in 3 batches of cinnamon extracts was 25.58%， 28.42%， 29.10%， respectively. Conclusion The method was proved simple， sensitive and reproducible， providing an effective tool for the quality control of cinnamon extracts.

Keywords：Cinnamomum Cassia； Tannins； Content Determination； Quality Control

肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮，具有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经脉的功能[1]，是我国历史悠久的一种常用的中药，也是世界流行的香料之一。研究发现，肉桂中含有挥发油、多糖类、多酚类、香豆素及无机元素等化学成分。肉桂，具有抗胃溃疡、抗炎、抗菌、抗肿瘤、预防糖尿病以及镇静、解痉、解热及缺血性脑卒中[2-3]等药理作用活性。

鞣质（tannins，又称单宁、丹宁）是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多酚类化合物[4-5]，具有收敛性，内服可用于治疗胃肠道出血、溃疡和水泻等症，外用于创伤、灼伤，局部止血[6]。现代研究表明，鞣质有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗脂质过氧化等多方面的生物活性[7-8]。鞣质是肉桂重要的化学成分和药效物质基础[9]。目前，针对肉桂及其提取物的质量研究多集中于挥发性成分[10]及香豆素[11]的控制，鲜有针对鞣质类成分的报道。

本研究以2015年版中国药典[12]规定的鞣质含量测定法为基础，采用磷钼钨酸-干酪素比色法建立肉桂提取物中鞣质的含量测定方法。此方法利用多酚在碱性溶液中将磷钼钨酸还原，产生深蓝色，其吸光度与含量成正比，以没食子酸为对照品，采用比色法测定。鞣质可与干酪素结合产生沉淀，因此分别测定总多酚和不被干酪素吸附多酚的含量，二者之差即为鞣质的含量[13]。本研究针对肉桂提取物的特点，对药典方法的实验参数进行了调整和优化，方法更为简单、灵敏、稳定。本研究丰富了肉桂及其提取物的化学成分和质量研究，为其进一步研究、开发和综合利用提供参考。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器 UV-2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；5510E-DTH超声仪（美国必能信公司）；Milli-Q超纯水机（Millipore公司）；SW22恒温震荡仪（美国优莱博公司）；CP225D电子分析天平（赛多利斯公司）。

1.2 试药材料 钨酸钠（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）、钼酸钠（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）、硫酸锂（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、碳酸钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）、盐酸（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）、磷酸（分析纯，广东光华化学厂有限公司）；干酪素（BR，上海麦克林生化科技有限公司）。没食子酸对照品（批号：140318，含量≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司，批号：140318）；肉桂提取物（昆药集团股份有限公司自制，批号：20150626，20151201，20160425，昆药集团股份有限公司）

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 磷钼钨酸溶液的制备 取钨酸钠100g、钼酸钠25g，置1000mL的圆底烧瓶中，加水700mL使溶解，加盐酸100mL、磷酸50mL，加热回流10h，放冷，再加硫酸锂150g、水50mL和溴0.2mL，煮沸除去残留的溴（约15min），冷却，加水稀释至1000mL，滤过，即得。避光保存，且本液不得显绿色。

2.1.2 对照品溶液的配制 精密称取没食子酸50mg置100mL容量瓶中，加水至刻度，精密量取5mL溶液置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，摇匀，即得（C=0.05mg/mL）。

2.1.3 供试品溶液的配制 精密称取60mg肉桂提取物置250mL容量瓶，加150mL水溶解，超声10min，放冷，用水稀释至250mL，摇匀，静置，过滤，弃去初滤液50mL。精密量取20mL续滤液置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

2.2 含量测定条件的考察与优化

2.2.1 测定波长的考察 精密移取对照品溶液和样品溶液各2mL置25mL容量瓶中，加1mL磷钼钨酸溶液，加10mL水，再用20%碳酸钠溶液稀释至刻度，反应30min，以相应试剂为空白，在400～900nm波长内进行全波长扫描，两者都在760nm处有最大吸收峰，故选择760nm作为检测波长。

2.2.2 碳酸钠溶液浓度的考察 精密量取对照品溶液和样品溶液各2mL置25mL容量瓶中，加1mL磷钼钨酸溶液，加10mL水，分别以1%、5%、10%、15%、20%、25%、29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，反应30min，以相应的试剂为空白，在760nm处测吸光度。结果随着碳酸钠溶液的浓度增大，吸光值也随着增大，在浓度为20%时，吸光值最大，之后吸光值就缓慢下降，且碳酸钠溶液浓度越大，越容易结晶。故选择碳酸钠溶液的浓度为20%。

2.2.3 碳酸钠溶液加入体积的考察 分别精密量取2mL对照品溶液置25mL容量瓶，各加1mL磷钼钨酸，分别加水18mL、14mL、10mL、6mL、4mL、2mL，用20%碳酸钠溶液稀释至刻度（分别加入4mL、8mL、12mL、16mL、18mL、20mL碳酸钠溶液），反应30min，以相应的试剂为空白，分别测吸光度。在加10mL水时（相当于所加碳酸钠体积为12mL），测得的吸光度值最大。故选择加入碳酸钠溶液体积为12mL。

2.2.4 干酪素用量的考察 为评价鞣质沉淀的效率，本研究对干酪素用量（200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg）进行了考察。结果表明，加入400mg干酪素时鞣质的含量最大，故选择干酪素的用量为400mg。

2.2.5 测定时间的考察 精密量取2mL对照品溶液置25mL容量瓶中，加1mL磷钼钨酸溶液，加水10mL，用20%碳酸钠溶液稀释至刻度。摇匀，以相应的试剂为空白，分别在5min、15min、25min、30min、35min、40min、50min、60min内测吸光度。结果显示，25min内测得的吸光度变化较大，25～35min之间测得的吸光值较稳定，35min后吸光度逐渐降低。故选择在25～35min内进行测定。

2.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL，分别置25mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸溶液1mL，再分别加水11mL、10mL、9mL、8mL、7mL、6mL，用20%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的试剂为空白，在760nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：y=101.17x-0.1296，R2=0.9997。结果表明，没食子酸对照品在0.0020～0.0120mg/mL浓度范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

2.4 方法学验证试验

2.4.1 精密度试验 取2mL对照品溶液，按“2.3”项下方法，自“加入磷钼钨酸溶液1mL”起，加水10mL，依法处理样品，连续测定6次。结果RSD=0.12%，结果表明方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验 精密称取肉桂提取物6份，按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.3”项下方法，自“加入磷钼钨酸溶液1mL”起， 加水10mL，依法测定吸光度，计算肉桂提取物中鞣质的平均含量为28.30%，RSD为0.53%，表明本方法重现性良好。

2.4.3 稳定性试验 精密移取2mL样品溶液，按“2.3”项下方法进行显色，自“加入磷钼钨酸溶液1mL”起，加水10mL，分别在显色后的15min、25min、30min、35min、40min、50min、60min处测定吸光度。结果显示，随着显示时间的延长，测得的吸光度下降，在15～35min内吸光度的RSD为0.97%。因此供试品溶液显示后35min内稳定。

2.5 样品的含量测定

2.5.1 总酚 精密量取供试品溶液2mL，置25mL棕色量瓶中，按“2.3”项下方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，并测定吸光度。从标准曲线方程中计算出样品中总酚的质量。

2.5.2 不被吸附的多酚 精密量取供试品溶液25mL，加入已盛有干酪素400mg的100mL具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，平行用水做一份干酪素空白实验。精密量取续滤液2mL，置25mL棕色量瓶中，，按“2.3”项下方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，并测定吸光度。从标准曲线中计算出样品中不被吸附的多酚的质量。

2.5.3 样品中鞣质的含量测定 鞣质含量（%）=（总酚量-不被吸附的多酚量）的浓度差×5×25×12.5/药材质量×100%。

3 讨论

鞣质的含量测定方法较多，如皮粉法、络合滴定法、干酪素法、高锰酸钾法等。其中，皮粉法是国际公认的鞣质含量测定方法，但耗用样品多，测定时间长，而且没有选择性。而干酪素法可以选择性的吸附有活性的鞣质，干酪素法选择性比皮粉法要高[14]，且现行中国药典采用了干酪素法，故选择干酪素法。本研究针对肉桂提取物的特点，对药典方法的实验参数，特別是干酪素加入量、碳酸钠浓度、显示时间进行了调整和优化，方法更为简单、灵敏、稳定。

鞣质的含量测定中显示剂较多，常用的有氯化铁、氯化铁-1，10 二氮杂菲、磷钼钨酸等，但磷钼钨酸比其他几种显示剂显色的颜色更深，灵敏度更高[13]。磷钼钨酸法的原理：在碱性溶液中，酚类化合物可以将磷钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚含量呈正相关，在约760nm波长处有最大吸收[15]。磷钼钨酸的颜色对鞣质的含量测定影响较大，因此磷钼钨酸需密封、避光保存，且不得显绿色。

有文献报道没食子酸不能被干酪素吸附[16-17]，在进行加样回收率考察时，加入的没食子酸经干酪素吸附后仍存在于溶液中，不能达到完全吸附，无法考察总鞣质含量回收率，因此本实验未做加样回收率试验。

本研究利用建立的分析方法对3批肉桂提取物进行了测定。结果表明，肉桂提取物常温放置的时间越久，测得的鞣质含量越低，这可能与鞣质不稳定的性质有关。因此肉桂提取物不要长时间放置，需低温保存。

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（收稿日期：2016-12-25 编辑：穆丽华）