主动脉弓缩窄诱发左心疾病相关的大鼠肺动脉高压制备方法

黄礼杰，陈洁娣，唐羽欣，刘青，孙晓鸥，谭文

(华南理工大学生物科学与工程学院/生物医药前孵化器研究中心/广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州510006)

主动脉弓缩窄诱发左心疾病相关的大鼠肺动脉高压制备方法

黄礼杰，陈洁娣，唐羽欣，刘青，孙晓鸥，谭文

(华南理工大学生物科学与工程学院/生物医药前孵化器研究中心/广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州510006)

目的探讨简单有效的左心疾病相关肺动脉高压(PH-LHD)大鼠模型的制备方法。方法雄性成年Wistar大鼠进行主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，TAC)手术，9周后检测大鼠左心室舒张末压、股动脉压、心输出量，并通过组织HE染色观察肺动脉血管的重构，通过免疫荧光染色观察肺间质Ⅰ型胶原的变化。结果主动脉弓缩窄9周后，大鼠的左心室舒张末压显著增加，心输出量、心率均显著降低，肺血管发生显著重构，管腔面积减小，同时肺间质Ⅰ型胶原显著增加。结论通过主动脉弓缩窄术成功制作了大鼠PH-LHD模型。

肺动脉高压；大鼠；主动脉弓缩窄；左心室舒张末压

左心疾病相关肺动脉高压是临床上的一类重要肺动脉高压疾病，属于第2类肺动脉高压。60%～80%的充血性心力衰竭患者伴有肺动脉高压，左心疾病是肺动脉高压最常见的诱因[1]。目前，国外虽有报道主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，TAC)术制备肺动脉高压小鼠模型[2]，但尚无文献报道利用TAC术制备左心疾病相关肺动脉高压大鼠模型。本研究采用TAC术制备左心疾病相关肺动脉高压大鼠模型，并主要通过对左心室舒张末压的测量和肺血管重构的观察来评价模型是否成功。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量180～220 g，购于广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号: SCXK(粤)2013-0034。

1.2 主要药品与试剂

戊巴比妥钠(齐云生物公司，批号:201202)；肝素钠(阿拉丁试剂公司，批号:k1207040)；苏木素(MERCK公司，批号:2013032001)；伊红(MERCK公司，批号:2013042701)；PBS磷酸盐缓冲剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号: 43P00150)；柠檬酸抗原修复缓冲剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号:43K00120)。

1.3 主要仪器

P23516 Powerlab数据采集分析系统(澳大利亚埃德仪器有限公司)；PL3516B49压力-容积测定系统(澳大利亚埃德仪器有限公司)；SPR-383Millar导管(美国MILLAR公司)；Model3000小动物呼吸机(美国MIDMRK集团KENT公司)；TP1020组织脱水机、EG1150H石蜡包埋机、DM4000正置显微镜、RM2255旋转切片机、ST5020多动能染色机(徕卡显微系统有限公司)；DHG-9053A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 将12只大鼠随机分为两组:假手术组(Sham组)、模型组(TAC组)，每组各6只。术后9周进行血流动力学评价。

1.4 造模方法

大鼠称质量，腹腔注射3%(φ)戊巴比妥钠(40 mg/kg)。麻醉后，置于手术台上(恒温垫控温37℃)，固定大鼠于仰卧位，气管插管，设置呼吸机呼吸频率70次/min，呼吸比1∶1，潮气量为4～6 mL/200 g。手术区域备皮碘伏消毒。从左胸部位斜向剪开皮肤，钝性分离两侧皮肤，暴露更多的肌肉。钝性分离出胸大肌和胸小肌。用眼科弯镊在第二和第三根肋骨间开胸，并小心拨开左右两片胸腺，暴露搏动的主动脉弓。在右无名动脉和左颈总动脉之间套进一根4-0的医用真丝编织线，把21G针头(外径为0.8 mm)沿主动脉自然生长的方向放置(见图1A)，结扎牢固后，抽出针头(见图1B)。继续通气15 min。待大鼠恢复自主呼吸后，解除呼吸机供气，放回笼子饲养。Sham组，除了不结扎主动脉弓外，其他步骤与TAC组相同。手术后喂养标准颗粒的饲料及饮用水。

图1 TAC造模结扎示意图Figure 1 Ligation diagram in TAC model

1.5 动物模型评价

1.5.1 血流动力学评价 大鼠造模9周后，进行血流动力学评价。根据体重，经腹腔注射3%的戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉成功后，固定，通呼吸机，具体步骤参考模型制备。手术区域备皮消毒。行颈部正中切口，钝性分离皮下组织及颈前正中肌肉，在呈“T”型的三块肌肉下找到右颈总动脉，用玻璃分针小心分离右颈总动脉伴行的迷走神经。在右颈总动脉下穿线，结扎右颈总动脉的远心端，在近心端置小动脉夹，穿线备用。用眼科剪在右颈总动脉近心端结扎处朝向心端方向呈45°角剪开“V”型小口，插入Millar导管后，于近心端处扎一个松结，松开动脉夹后，往心脏方向缓缓递入Millar导管，遇到阻力时可适当回退，再继续前进，直至电脑屏幕上呈现出正常稳定的压力-容积环即停止Millar导管递送。为避免Millar导管脱落，扎紧近心端的松结，监测左心室收舒张末压、心率及心输出量。

使用血压计给予压力传感器0 mmHg和100 mmHg的压力，使用两点定标法定标。对大鼠左下肢腹股沟进行备皮消毒，分离股动脉，结扎远心端，于近心端穿线备用，并动脉夹夹闭近心端，在近心端结扎处朝向心端方向呈45°角剪一“V”型小口，立即插入充满含1%肝素的生理盐水的PE10导管。待松开动脉夹后，继续往向心端插入，扎紧导管。

1.5.2 组织病理学评价 血流动力学监测完毕后，开胸检测造模时所用线栓是否完整，若线栓断裂或脱落，则视为造模失败，该只大鼠不再进行后续实验；若线栓完好，用手术剪将肺组织和心脏取下，用PBS洗2次后，吸尽表面液体，称质量。从气管插入软管，对肺组织进行10%(φ)甲醛溶液灌流固定。灌流3～5 min后，待肺组织完全撑开，用细线系紧气管，置于已经装有10%甲醛溶液的病理袋中，并在肺组织表面放2小块纱布，防止肺组织浮出液面。肺组织标本固定48 h后，取肺组织左肺叶，切去中间约1 cm宽度肺组织，组织脱水后石蜡包埋。

每组随机取3只大鼠肺组织，切成5 μm厚的切片，封固于黏附型载玻片上。将石蜡切片60℃烤箱内烘烤1.5 h，按设定程序进行HE染色。

对已经HE染色的石蜡切片进行观察并扫描肺动脉血管图片。使用Image-Pro plus 6.0软件对所拍肺动脉血管图片进行盲法分析。将肺动脉血管按照直径分为2类:小型血管(直径为20～100 μm)，大型血管(直径为100～500 μm)[6]。对所有肺动脉血管进行血管中层厚度测定。

1.5.3 免疫荧光观察 取已经切好的石蜡切片，60℃烘箱中烤片脱蜡90 min后，立即置于多功能染色机中，进行脱蜡。脱蜡完毕后，用PBS洗3次，每次5 min。然后，置于95℃的柠檬酸中10 min，进行抗原修复。抗原修复完后，切片在柠檬酸中冷却至室温。再用PBS洗3次，每次5 min。然后，室温下，用0.5%Triton X-100进行通透处理20 min。再用PBS洗3次，每次5 min。然后，用5%BSA在室温下封闭20～30 min。滴加一抗(1∶500)，4℃孵育过夜。第2天，用PBS洗3次，每次5 min。再滴加二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h。用PBS洗4次，每次5 min。滴加DAPI染色7 min，用PBS洗3次，每次5 min，于激光共聚焦显微镜下观察。

1.5.4 统计分析 左心舒张末压、平均股动脉压、心率、心输出量均由PowerLab软件获得。结果用±s表示，用Graphpad prism 5行统计分析。用t检验比较不同组间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学参数

与Sham组相比，TAC组左心舒张末压显著升高，心率、心输出量显著降低(表1)。

表1Sham组和TAC组大鼠血流动力学参数对比Table 1Comparison of hemodynamic parameters in sham and TAC rats(±s，n＝6)

表1Sham组和TAC组大鼠血流动力学参数对比Table 1Comparison of hemodynamic parameters in sham and TAC rats(±s，n＝6)

与Sham组比较:∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

组别 左心舒张末压/mmHg 平均股动脉压/mmHg 心率/(次·min－1) 心输出量/(mL·min－1) Sham组 2.563±1.024 130.052±7.589 448.0±10.8 56.93±2.90 TAC组 21.653±2.042∗∗111.812±5.699 390.1±15.9∗40.84±3.40∗∗

2.2 血管重构

与Sham组相比，TAC组肺动脉血管中层增厚，血管发生严重肌化现象，且管腔面积减小(图2)。

对于血管直径＜100 μm的血管，与Sham组相比，TAC组大鼠中层厚度显著增加(P＜0.01)(图3)；对于血管直径＞100 μm的血管，与Sham组相比，TAC组大鼠中层厚度显著增加(P＜0.05)(图4)。

图2 Sham组和TAC组肺动脉血管重构比较(400×)Figure 2 Comparison of vascular remodeling in sham and TAC rats(400×)

2.3 肺间质Ⅰ型胶原变化

通过免疫荧光染色，发现TAC组大鼠肺间质Ⅰ型胶原显著增加(图5)，提示肺间质发生纤维化。

图3 小型血管(直径为20～100 μm)肺动脉血管中层增厚程度(n＝3)Figure 3 Medial thickness in small vessels(n＝3)

图4 大型血管(直径为100～500 μm)肺动脉血管中层增厚程度(n＝3)Figure 4 Medial thickness in large vessels(n＝3)

图5 Sham组与TAC组肺间质Ⅰ型胶原比较(630×)Figure 5 Comparison of pulmonary interstitial collagenⅠin sham and TAC rats(630×)

3 讨论

目前，左心疾病相关肺动脉高压大鼠模型主要是通过升主动脉缩窄获得，并通过测量右心室压或肺动脉压来验证模型的成功[3-4]。然而，一方面，相比于TAC术，升主动脉缩窄术造模大鼠易发急性左心衰竭，成活率较低[5]。另一方面，测量右心室压或肺动脉压需要将米勒导管经过上腔静脉、右心房，到达右心室，或继续突破肺动脉瓣进入肺动脉。在插管过程中，导管很容易插入下腔静脉，也很难通过三尖瓣进入右心室，经常导致导管到位失败[6]。

国外有报道采用TAC术制备左心室相关肺动脉高压小鼠模型，但尚无采用大鼠制备该种疾病模型的文献报道。本研究采用TAC术制备左心疾病相关肺动脉高压大鼠模型。在右无名动脉和左颈动脉之间结扎，具有较好的辨识性对大鼠伤害较小[7]。另外，本研究将左心室舒张末压作为评价模型成功的主要指标，从右颈总动脉插管后经升主动脉进入左心室，测量左心室舒张末压，操作简单方便，较好地避免了上述右心室压测量过程中存在的问题。

在肺循环中，来源于上下腔静脉的静脉血经过右心房到达右心室，被右心室泵出进入肺动脉，再进入各级分支肺动脉，进入肺泡周围毛细血管网，进行气体交换。静脉血变成动脉血，再经肺内各级肺静脉属支进入肺静脉，再进入左心房，左心室。然后被左心室泵出进入全身体循环(见图6)。由于左心房的压力与左心室的压力基本一致，主动脉弓结扎后(见图6)，左心室舒张末压压力升高，左心房的压力随之升高(即肺动脉楔压升高)，导致压力反向传导，使肺动脉压被动升高[8]。因此，左心室舒张末压的升高可以推导出肺动脉压升高[2]。

图6 肺循环及主动脉弓结扎示意图Figure 6 Diagram of pulmonary circulation

本研究以左心室舒张末压大于20 mmHg作为评判大鼠肺动脉高压模型成功的标准。TAC术9周后，TAC组6只大鼠只有1只左心室舒张压小于20 mmHg，且TAC组大鼠左心室舒张末压相比于假手术组有极显著升高，说明TAC手术9周后成功建立大鼠肺动脉高压模型。

肺动脉高压过程中，肺动脉血管内皮功能紊乱，导致血管中层平滑肌细胞过度增殖，以至于血管中层增厚，甚至血管肌化，进而使血管阻力增加，肺动脉高压进一步恶化[9-10]。

本研究通过HE染色发现，TAC组大鼠直径为20～100 μm的肺细动脉中层显著增厚，直径为100 ～500 μm的肺阻力血管肺肌性动脉中层也显著增厚且肌化严重，血管管腔面积减小。免疫荧光染色也发现，TAC组大鼠肺间质Ⅰ型胶原增加，提示肺部出现纤维化，肺弹性减弱。这些肺组织病理表现与TAC诱发肺动脉高压小鼠模型的病理特征一致[2]，进一步验证了该左心疾病相关肺动脉高压大鼠模型符合要求。

综上所述，本研究通过TAC手术成功制备了左心疾病相关肺动脉高压的大鼠模型。

[1]YIN J，KUKUCKA M，HOFFMANN J，et al.Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure [J].Circ Heart Fail，2011，4(2):198-206.

[2]CHEN Y，GUO H，XU D，et al.Left ventricular failure produces profound lung remodeling and pulmonary hypertension in mice:heart failure causes severe lung disease[J].Hypertension，2012，59(6):1170-1178.

[3]YIN N，KAESTLE S，YIN J，et al.Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease[J].Crit Care Med，2009，37(3):980-986.

[4]HENTSCHEL T，YIN N，RIAD A，et al.Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure[J].Anesthesiology，2007，106(1):124-131.

[5]李晓梅，马依彤，杨毅宁，等.小鼠主动脉弓缩窄模型的建立及评价[J].中国比较医学杂志，2008，18(11):24-29，插2.

[6]张蕙.左心疾病所致的肺动脉高压中肥大细胞聚集和肺血管重构的时间相关性[D].福州:福建医科大学，2013.

[7]周亚光，屠恩远，王照华，等.大鼠胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚模型的建立[J].中国比较医学杂志，2008，18 (12):21-24.

[8]MONTANI D，GUNTHER S，DORFMULLER P，et al. Pulmonary arterial hypertension[J].Orphanet J Rare Dis，2013(8):97.

[9]CROSSWHITE PATRICK，SUN Zhongjie.Molecular mechanisms of pulmonary arterial remodeling[J].Mol Med，2014(20):191-201.

[10]ADIR Y，AMIR O.Pulmonary hypertension associated with left heart disease[J].Semin Respir Crit Care Med，2013，34:665-860.

(责任编辑:王昌栋)

A method of establishing pulmonary arterial hypertension by transverse aortic
constriction in rats

HUANG Lijie，CHEN Jiedi，TANG Yuxin，LIU Qing，SUN Xiaoou，TAN Wen
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo explore a simple and effective model of pulmonary arterial hypertension due to left heart disease(PH-LHD)in rats.MethodsAdult male Wistar rats were performed by transverse aortic constriction surgery.After 9 weeks，left ventricular end diastolic pressure，femoral artery pressure，cardiac output and heart rate were chronologically collected.The pulmonary artery vascular remodeling was observed by hematoxylin-eosin staining.The pulmonary interstitialcollagenⅠ wasobserved by immunofluorescent staining.ResultsCompared with the sham group，the left ventricular end diastolic pressure was obviously increased，but the cardiac output and heart rate were significantly decreased in the model group.The vascular remodeling and reduced pulmonary artery lumen size were observed in the model group.Pulmonary interstitial collagenⅠwas increased in the model group.ConclusionA stable PH-LHD rat model could be successfully established by transverse aortic constriction in this research.

pulmonary arterial hypertension；rat；transverse aortic constriction；left ventricular end diastolic pressure

R－331

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.023

1006-8783(2015)05-0661-05

2015-05-21

广东省重大科技专项(2012A080204001)；广州市重大专项科技项目(201300000051)

黄礼杰(1987—)，男，2012级硕士研究生，Email:huanglijiew＠163.com；通信作者:谭文，男，教授，主要从事医药生物学研究，Email:went＠scut.edu.cn。

时间:2015-09-17 11:49

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150917.1149.002.html