香椿子石油醚提取物对大鼠糖尿病肾病的保护作用

李万忠，王晓红，韩玮娜，刘冬梅

潍坊医学院药学院，潍坊 261053

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是多病因的代谢疾病，发病机制是国内外研究的重点和热点［1］。目前对DN 防治尚无有效方法，化学药虽对血糖、降压、降脂、抗凝等有较好控制，但毒副作用相对较大。基于此，寻找安全、有效、来源丰富的天然产物对于DN 治疗有重要意义。山东地区民间使用香椿子泡水或煎服，对DN 具有较好疗效。香椿子有降糖、抗凝血、抗氧化、保护神经细胞等作用［2-6］，所以香椿子不失为一种有市场潜力的干预DN 物质来源。本文研究香椿子石油醚提取物对DN 大鼠肾脏的保护作用，可为DN 临床防治提供一定理论依据。

1 材料与仪器

1.1 药物

香椿子，购自济南圣科技术开发有限公司，经潍坊医学院生药学教研室许崇梅博士鉴定为楝科香椿属植物香椿Toona sinensis(A.Juss.)Roem.的果实;香椿子石油醚提取物由潍坊医学院药学专业实验室自制。

1.2 试剂

链脲佐菌素 STZ (Sigma 公司，批号031M1287V);检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);抗体购自Sigma-Aldrich 公司与Santa Cruz 公司。

1.3 设备

酶标仪(Bio-Rad 公司);血糖仪(罗氏公司);全自动生化分析仪(日立公司):光学显微镜(Olympus公司);透射电镜(TEM，日立H-7650)。

1.4 动物

健康清洁级雄性Wister 大鼠，体重(200 ±20)g，合格证号为SCXK 鲁20130001，购于山东省鲁抗医药动物实验中心。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药

180～200 g 雄性Wistar 大鼠，适应性喂养1 周后，随机抽取10 只为正常组，普通饲料喂养;造模大鼠25 只喂以高脂高糖饲料(上海斯莱克实验动物有限公司提供)，4 周后STZ 60 mg/kg 造模，血糖介于16.7～25.0 mmol/L 者继续喂养，尿蛋白超过20 μg/min，DN 模型成功建立;将DN 大鼠随机分为模型组9 只、PEE 干预组11 只;PEE 干预组5 mg/100 g·d 连续灌胃10 周，其余两组灌胃等量生理盐水。

2.2 标本收集

大鼠于末次给药后单笼收集24 h 尿液，离心，4℃保存。大鼠于末次给药后称体重，水合氯醛按体重腹腔注射，麻醉后心脏取血，离心，留取血清-20℃保存备用。心脏插管注入4 ℃生理盐水灌洗至肾脏色白，摘取双肾去掉包膜称重，留取肾脏电镜标本，其余部分多聚甲醛固定待用。

2.3 指标检测

2.3.1 血、尿指标

测定大鼠空腹血糖FBG、血肌酐Scr、尿肌酐Ucr、尿素氮BUN;试剂盒测定尿蛋白、HbAlc、血清T-AOC、SOD、MDA、GSH-PX、CAT 含量。

2.3.2 肾脏系数

肾脏系数=肾质量(mg)/体质量(g)

2.3.3 肾脏病理指标

取多聚甲醛固定样本，石蜡包埋，常规切片，进行HE、PAS、PASM、Masson 染色，光镜观察大鼠肾脏病理变化。

2.3.4 免疫组化检测

运用显微镜对每样本免疫组化(TGF-β1、CTGF、collagen IV)选取放大400 倍5 个视野拍照，Isolutions 软件对阳性结果定量分析，得出各组平均阳性强度。

2.3.5 肾脏电镜观察

取肾脏电镜标本，经固定染色后，在透射电镜下观察。

2.4 统计学方法

3 实验结果

3.1 香椿子石油醚提取物对DN 大鼠体重与血糖的影响

与正常组相比，模型组体重明显减轻(P＜0.01);肾脏系数升高(P＜0.01);血糖明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，PEE 干预组体重明显增加(P＜0.01);肾脏系数降低(P＜0.05);血糖明显降低(P＜0.01)，见表1。

表1 各组大鼠体重、肾脏指数及肾功相关参数Table 1 Body weight，index of renal hypertrophy and renal function-related parameters in different groups at the end of treatment

注:与正常组比较，aP ＜0.05，bP ＜0.01;与模型组比较，cP ＜0.05，dP ＜0.01。Note:compared with normal group，aP ＜0.05 andbP ＜0.01;compared with model group，cP ＜0.05 and dP ＜0.01.

3.2 香椿子石油醚提取物改善DN 大鼠的肾功能

与正常组相比，模型组大鼠的24 h 尿量、尿蛋白、HbAlc、BUN、Scr 显著上升(P＜0.01);Ucr 明显降低(P＜0.01)。与模型组相比，PEE 干预组的24 h 尿量、尿蛋白、HbAlc、BUN、Scr 大幅减少(P＜0.01或P＜0.05);Ucr 明显提升(P＜0.01)，见表1。

3.3 香椿子石油醚提取物对DN 大鼠氧化应激指标的影响

与正常组相比，模型组大鼠的T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT 活性显著降低(P＜0.01)，MDA 水平明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，PEE 干预组的T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT 活性增加P＜0.01 或P＜0.05)，MDA 水平明显降低(P＜0.05)，见表2。

3.4 香椿子石油醚提取物改善STZ 糖尿病大鼠肾脏的病理损伤

HE、PAS、PASM、Masson 染色观察各处理组肾脏的病理变化，对PAS、PASM、Masson 染色进行定量分析计算肾小球硬化指数和肾小球纤维化面积百分比。正常组大鼠肾脏病理无明显变化;与正常组相比，模型组大鼠肾小球肥大，鲍曼囊变窄，毛细血管管腔变窄，系膜区细胞外基质沉积增加，糖原沉积明显增多，胶原沉积明显增多;PEE 干预组大鼠肾脏上述病理损伤较STZ 组得到明显改善(P＜0.05)，见图1。

图1 不同处理组大鼠对肾脏病理变化的影响Fig.1 Histopathological changes in the kidneys of DN rats with PEE treatment

表2 不同处理组大鼠对抗氧化指标影响Table 2 Content of antioxidant indexes in experimental rats at the end of treatment

图2 各组大鼠肾脏透射电镜下结构变化(×7000)Fig.2 Structural changes were observed in the kidneys of DN rats by TEM (×7000)

3.5 肾脏病理电镜观察

透射电镜下正常组肾脏结构正常，肾小球GBM均匀无增厚，上皮足突分布均匀;模型组大鼠肾脏组织部分GBM 增厚明显，厚薄不均，呈驼峰状，部分足突、次级突起融合明显，部分血管内皮细胞增生、裂孔减少明显。干预组大鼠肾脏组织表现为节段性GBM 中等增厚，足突融合明显，有不同程度改善，见图2。

3.6 免疫组化检测各组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF、collagen IV 表达

氧化应激可通过活化TGF-β1、CTGF、collagen IV 信号通路，诱导细胞因子分泌以及细胞外基质合成和沉积，导致肾小球硬化。空白组TGF-β1、CTGF、collagen IV 蛋白水平没有明显差异;与正常组相比，模型组肾脏组织内TGF-β1、CTGF、collagen IV 蛋白水平显著增高;与模型组DN 相比，PEE 干预组肾脏组织内TGF-β1、CTGF、collagen IV 蛋白水平明显降低(P＜0.05)，见图3。

4 结论与讨论

DN 发病机制复杂，迄今尚不清楚。氧化应激激活几乎所有糖尿病并发症相关病理通路，是DN发病机制的核心环节［7］，目前认为氧化应激是重要的共同机制。氧化应激在DN 发生发展中主要表现为肾系膜细胞和上皮细胞氧自由基生成增多，导致细胞受到损伤。PEE 提高SOD、CAT、GSH-Px 活性及总抗氧化力，探讨氧化应激在DN 发病机制中作用，可为DN 防治提供理论依据。

采用先喂高脂饲料，诱发胰岛素抵抗，再行STZ注射，破坏胰岛组织，产生糖尿病模型，与临床2 型糖尿病发病相似;在此基础上，又饲喂高热量饮食，出现持续高血糖、蛋白尿等病理改变，成功建立大鼠DN 模型。

DN 大鼠早期病理改变为肾小球肥大、肾小球现高压、高灌注、高滤过、蛋白尿等表现。PEE 降低DN 大鼠24 h 尿量、尿蛋白、HbAlc、BUN、Scr 等，调整DN 大鼠糖代谢，减少尿蛋白排出［8］，有一定改善DN 大鼠肾功能作用。

TGF-β1 是重要的致纤维化因子［9］，CTGF 刺激成纤维细胞增殖、细胞外基质产生、纤维化，两者促进肾成纤维细胞胶原生成，在DN 发生发展中有重要作用。Col IV 是糖尿病肾病重要标志物之一［10］，水平高低对反映糖尿病肾病发生、发展与转归有重要理论意义和应用价值。PEE 对DN 大鼠肾脏具有保护作用，为香椿子防治DN 提供初步试验依据，至于具体物质基础及作用机制有待进一步研究。

图3 免疫组化比较不同组大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、collagen IV 表达Fig.3 Expression of TGF-β1，CTGF and collagen IV in the kidneys of DN rats with PEE treatment

1 Kitada M，Kanasaki K，Koya D.Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease.World J Diabetes，2014，5:342-356.

2 Xing SS(邢莎莎)，Chen C(陈超).Studies on hypoglycemic effects of total polyphenols from the seeds ofToona sinensis.Pharmacol Clin Chin Mater Med(中药药理与临床)，2011，27(3):42-44.

3 Xing SS(邢莎莎)，Chen C(陈超).Study on the antioxidation of polyphenols from the seeds ofToona sinensisJuss)Roemin vitro.J Anhui Agric Sci(安徽农业科学)，2010，38:7285-7287.

4 Rao YQ(饶娅琦)，Chen C(陈超)，Zhao B(赵博).Blood anticoagulation effects ofToona sinensisseed.J Sichuan TCM(四川中医)，2008，26(11):58-61.

5 Jin GL(金桂兰)，Chen C(陈超).Antithrombotic effects ofToona sinensisseeds decoction.China Pharm(中国药房)，2011，22:1364-1366.

6 Zhao Q(赵琼)，Sun QY(孙黔云)，Yang QX(杨庆雄).Protective effects of a polyphenol from the seed ofToona sinensison activation and injury of endothelial cell induced by complement.Chin Pharm Bull(中 国 药 理 学 通 报)，2011，27:1041-1044.

7 Chen Y(陈洋)，Fu T(付婷)，Jiang AH(姜爱花).Relationship between oxidative stress and diabetic nephropathy.J Mil Surg Southwest China(西南军医)，2012，14:278-280.

8 Singh VP，Bali A，Singh N，et al.Advanced glycation end productsand diabetic complications.Korean J Physiol Pharmacol，2014，18:1-14.

9 Huang S(黄姗)，Cao WF(曹文富).The effect of JJFSN on the expression of TGF-β1 mRNA，Ⅳcollagen protein and HGF in the kidney of diabetic rats.J Fourth Mil Med Univ(第四军医大学学报)，2009，30:1345.

10 Dronavalli S，Duka I，Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy.Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4:444-452.