氨基酮戊酸光动力疗法抑制成纤维细胞生长因子10诱导的HaCaT细胞过度角化及增殖的机制研究

易飞 Maya Valeska Gozali张家安 周炳荣 骆丹 张丽超 王申 刘娟 吴红巾

氨基酮戊酸光动力疗法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）不仅对炎症性痤疮皮损有改善作用，对非炎症性痤疮皮损（如粉刺等）亦有显著的改善作用［1-2］。此外，ALA-PDT疗法在治疗痤疮的过程中，同时还作用于毛囊皮脂腺导管上皮细胞的角化过程，但是该作用机制尚未得到完全明确［3-5］。目前尚未在体外模型中进行ALA-PDT疗法对细胞过度角化的影响及其机制的研究。本研究以成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF-10）诱导的HaCaT细胞过度角化及增殖模型为研究对象，探讨ALA-PDT对该模型角化及增殖指标的影响，初步探讨其作用机制。

材料与方法

一、材料与仪器

HaCaT细胞由上海长海医院皮肤科惠赠。氨基酮戊酸粉剂（上海复旦张江生物医药股份有限公司，商品名为艾拉，批号130702），FGF-10（美国R&D system公司），胰酶（美国Amresco生物公司），培养基为含10%胎牛血清DMEM（美国Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit 8，上海碧云天生物技术有限公司），实时定量PCR试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），白细胞介素1α（IL-1α）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R&D system公司），兔抗人多克隆抗角蛋白 6（keratin-6，K6）、K16、K1 抗体（美国Abcam公司），兔抗人多克隆抗角质形成细胞生长因子受体抗体（KGFR，美国Santa Cruz公司）。XD-635AB型光动力激光治疗仪（波长635 nm，上海复旦张江生物医药股份有限公司），FV500型共聚焦荧光显微镜（日本Olympus公司）。

二、方法

1.HaCaT细胞培养与传代：HaCaT细胞培养于37℃、5%CO2条件培养箱中。80%融合时以0.25%胰酶消化，用含10%小牛血清的DMEM培养基调整为1×106/ml，定量接种于10 cm培养皿中，待其贴壁长至70%～80%融合时用于实验。

2.处理及分组：HaCaT细胞共分为4组，空白对照组（无任何处理），FGF-10组（加入FGF-10孵育24 h），ALA-PDT组（ALA孵育24 h后红光照射），FGF-10+ALA-PDT组（FGF-10孵育24 h后，再加ALA孵育24 h后红光照射）。FGF-10以薄层磷酸盐缓冲液（PBS）溶解后，-20℃避光保存，使用时吸除细胞培养基，细胞表面覆以PBS，加入浓度为100 μg/L的FGF-10，孵育24 h后吸除FGF-10，换含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。ALA溶液为现配的1 mmol/L ALA+DMEM培养液，加入细胞培养皿中避光培养24 h，弃去培养液，PBS漂洗3遍，加入1 ml PBS防止干涸，采用635 nm红光照射，距离细胞10 cm，功率50 mW/cm2，光照后弃去原培养液，PBS洗3遍，吸尽液体。另外，在ELISA检测实验组中，用不含小牛血清的DMEM培养基培养。各组按上述要求处理后24 h进行下面的检测。

3.HaCaT细胞增殖活性检测：按上述分组处理后，每孔再加入10 μl CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，选择波长490 nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A值），实验重复3次。

4.Western 印迹法检测 K1、K6、K16、KGFR：经上述分组处理后，分别提取细胞总蛋白，将蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），250 V 电压下电泳 2 h，200 mA 100 V 转印1 h，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭液中封闭，4℃过夜，弃去封闭液，不洗。封闭后按实验分组分别加入一抗 K1（1∶10000）、K6（1∶5000）、K16（1 ∶1 000）、KGFR（1 ∶1 000）4 ℃孵育过夜，再加入二抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶标记抗体，用封闭液（1∶5 000）室温下振荡孵育2 h，显色液室温下显色。用灰度分析软件Image Tool 3.00进行条带分析。

5.ELISA法检测细胞上清液中IL-1α蛋白：空白对照组仅DMEM培养72 h；FGF-10组加DMEM培养24 h后，加入FGF-10孵育24 h，再换DMEM培养24 h；ALA-PDT组加DMEM培养48 h后,再加ALA孵育24 h后红光照射；FGF-10+ALA-PDT组加DMEM培养24 h后加入FGF-10孵育24 h，再加ALA孵育24 h后红光照射。照射红光后需避光3 h。严格按照ELISA试剂盒测定方法检测上述各组细胞上清液IL-1α的含量，按操作说明测量波长为450 nm时的A值。

6.细胞免疫荧光法检测KGFR和K6表达：将上述各组细胞用固定液固定10 min，洗涤后加入免疫封闭液封闭1 h，再洗涤后分别加入KGFR（1∶500）和 K6（1 ∶100）抗体，4 ℃过夜，次日洗涤后加入羊抗兔IgG，湿盒中避光孵育37℃1 h，洗涤后加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色液对核进行复染5 min，37℃避光染色，加入抗荧光淬灭剂封片观察。用高倍镜（×400）观察样品，DAPI由氩离子激光器358 nm激发，分辨率为1 024×1 024，发射波长为460 nm。

7.统计学方法：采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，采用析因设计资料的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、ALA-PDT对FGF-10诱导的HaCaT细胞增殖的影响

析因分析显示，各组经处理后24 h，ALA-PDT和FGF-10对HaCaT细胞增殖无交互作用（F交互=1.369，P=0.276），FGF-10 对 HaCaT 细胞增殖有促进作用（F=20.853，P＜0.05），而ALA-PDT对HaCaT细胞增殖有抑制作用（F=24.822，P＜0.05）。FGF-10组细胞增殖活性（A值为1.233±0.099）较空白对照组（0.924±0.024）显著升高（P＜0.05），而 ALA-PDT组细胞（0.718±0.107）较空白对照组则显著降低（P＜0.05），FGF-10+ALA-PDT组细胞增殖活性（0.901±0.014）与FGF-10组比较也显著降低（P＜0.05）。

二、ALA-PDT对FGF-10诱导的HaCaT细胞K1、K6、K16及 KGFR 表达的影响

Western印迹法结果显示，ALA-PDT和FGF-10对HaCaT细胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表达有交互作用（F交互值分别为 118.370、341.141、403.985、152.647，均P＜0.05），根据相加模型均判断为负效应。FGF-10促进K1、K6、K16及KGFR蛋白表达（F值分别为 369.832、838.381、328.397、691.260，均P＜0.05），而ALA-PDT抑制这些蛋白的表达（F值分别为 407.319、919.896、788.253、571.337，均P＜0.05）。单独效应分析显示，FGF-10组角蛋白K1、K6和K16及KGFR相对表达量均显著高于空白对照组（均P＜0.05），ALA-PDT组均显著低于空白对照组（均P＜0.05），而FGF-10+ALA-PDT组显著均低于FGF-10组（均P＜0.05）。见图1，表1。

图 1 Western印迹法检测HaCaT 细胞角蛋白（K）1、K6、K16、角质形成细胞生长因子受体（KGFR）蛋白表达变化 1：空白对照组；2：成纤维细胞生长因子 10（FGF-10）组；3：ALA-PDT 组；4：FGF+ALA-PDT 组。FGF-10+ALA-PDT 组 K1、K6、K16、KGFR 蛋白表达水平与FGF-10组相比均明显下降

表1 ALA-PDT与FGF-10对HaCaT细胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表达的影响（±s）

表1 ALA-PDT与FGF-10对HaCaT细胞K1、K6、K16及KGFR蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。ALA-PDT：氨基酮戊酸光动力疗法；FGF-10：成纤维细胞生长因子10；K：角蛋白；KGFR：角质形成细胞生长因子受体。a：Western印迹法检测；b：细胞免疫荧光法检测

组别 灰度值a K 1 K 6 K 1 6 K G F R K 1 6 K G F R空白对照组 1.0 0 0±0.0 6 1 1.0 0 0±0.1 0 4 1.0 0 0±0.0 5 9 1.0 0 0±0.0 5 6 1 0.5 8 6±2.3 9 5 1 3.5 4 9±1.8 2 8 F G F-1 0组 2.2 9 8±0.1 3 1 3.4 3 8±0.0 9 2 2.9 3 2±0.0 2 4 2.6 3 9±0.1 2 5 7 8.2 8 6±4.7 4 0 7 0.4 2 9±2.3 9 1 A L A-P D T组 0.5 9 9±0.0 2 9 0.3 9 1±0.0 6 3 0.5 9 6±0.1 3 5 0.3 7 0±0.0 2 4 7.6 1 9±1.1 8 1 6.5 0 2±1.2 2 1 F G F-1 0+A L A-P D T组 0.9 5 9±0.0 2 4 0.9 3 0±0.0 9 2 0.4 9 6±0.0 9 1 0.8 9 2±0.0 7 2 1 8.4 6 8±2.9 0 1 4 2.7 8 0±2.0 8 1荧光强度b

图2 激光共聚焦倒置荧光显微镜观察HaCaT细胞角蛋白6（K6）的免疫荧光图像（×400） 蓝色为4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色液标记，指示核区；绿色指示K6，荧光强度越强，表达越高。成纤维细胞生长因子10（FGF-10）+ALA-PDT组K6荧光强度与FGF-10组相比明显下降

图3 激光共聚焦倒置荧光显微镜观察HaCaT细胞角质形成细胞生长因子受体（KGFR）的免疫荧光图像（×400） 蓝色为4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色液标记，指示核区；绿色指示KGFR，荧光强度越强，表达越高。成纤维细胞生长因子10（FGF-10）+ALA-PDT组KGFR荧光强度与FGF-10组相比明显下降

细胞免疫荧光法检测显示，ALA-PDT和FGF-10对HaCaT细胞K6和KGFR免疫荧光强度有交互作用（F交互=173.174、85.561，均P＜ 0.05），且为负效应。FGF-10可增强K6和KGFR免疫荧光强度（F值分别为 370.766、1 749.468，均P＜ 0.05），而ALA-PDT降低K6和KGFR免疫荧光强度（F值分别为 219.810、242.681，均P＜ 0.05）。单独效应分析显示，FGF-10组K6和KGFR免疫荧光强度均显著高于空白对照组（均P＜0.05），ALA-PDT组低于空白对照组（均P＜0.05），FGF-10+ALA-PDT组低于FGF-10组（均P＜0.05）。见图 2、3，表1。

三、ALA-PDT对FGF-10诱导的HaCaT细胞IL-1α蛋白分泌的影响

ELISA法结果显示，ALA-PDT和FGF-10对HaCaT细胞IL-1α蛋白分泌无交互作用（F交互=0.006，P=0.939）。FGF-10 会增加 IL-1α 蛋白分泌（F=14.996，P＜0.05），而ALA-PDT对其没有影响（F=0.584，P=0.467）。FGF-10组IL-1α 蛋白分泌水平（A值为0.282±0.029）显著高于空白对照组（0.207±0.036），差异有统计学意义（P＜0.05）；ALA-PDT组（0.194±0.035）与空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；FGF-10+ALA-PDT组（0.266±0.031）显著低于FGF-10组（P＜0.05）。

讨 论

大量研究证实，FGF-10能促进角质形成细胞的增殖及过度角化［6］。同时发现，FGF-10能促进毛囊导管上皮细胞过度角化，产生粉刺、炎症等一系列改变［7］。有研究［4］认为，当给予适宜波长的光进行照射时，不仅可以激活痤疮丙酸杆菌自身产生的内源性卟啉，还能同时活化外源性ALA所转换的PpIX（原卟啉IX），产生ROS，通过选择性地杀伤痤疮丙酸杆菌和破坏毛囊皮脂腺而改善痤疮症状。然而，Hörfelt等［4］使用 20%ALA+ 不同红光照射剂量方案治疗后发现，明显改善的痤疮皮损中皮脂腺分泌水平和痤疮丙酸杆菌的相对数量都没有发生明显改变，认为ALA-PDT疗法在改善痤疮的过程中，可能同时还作用于毛囊皮脂腺导管上皮细胞的角化过程。我们通过前期研究和查阅文献［8-9］，分别选择 1 mmol/L ALA 和 100 μg/L FGF-10，孵育 3 h，红光照射剂量为50 mW/cm2。在本实验中，HaCaT细胞经FGF-10孵育后，与空白对照组相比，角蛋白K6、K16及K1表达增加，进一步验证了FGF-10确实可诱导角质形成细胞的过度角化。进一步发现，ALAPDT能下调FGF-10诱导的HaCaT细胞K6、K16及K1蛋白的表达，提示ALA-PDT可抑制角质形成细胞过度角化及增殖。

大量研究表明，IL-1α能诱导角质形成细胞的过度角化［10］，Guy 和 Kealey［11］在体外分离培养的毛囊皮脂腺导管模型中，加入1 μg/L IL-1α可以促进毛囊皮脂腺导管的角化过度。此外，开放性粉刺中含有高浓度的IL-1α，在毛囊皮脂腺导管上皮细胞中IL-1α的浓度是其他组织的1 000倍［12］。毛囊皮脂腺导管上皮细胞角化过度和增生过度常伴随着K1、K6和K16的过度表达，IL-1α能通过自分泌方式诱导K1、K6和K16表达，激活基底层的角质形成细胞［13］。多种具有明确抗痤疮作用的药物（如异维A酸、抗雄激素药物、过氧苯甲酰等）均可通过下调IL-1α表达来发挥疗效［14］。在本实验中我们发现，ALA-PDT能下调FGF-10诱导的HaCaT细胞IL-1α蛋白的表达，提示ALA-PDT调节角化异常的作用可能与抑制IL-1α的表达相关。

KGFR/FGFR2b信号通路也被认为和毛囊漏斗部的过度角化有关［7，15-16］。KGFR/FGFR2b 是一类跨膜的酪氨酸激酶受体，有两个亚型，分别是FGFR2b和FGFR2c。KGFR/FGFR2b主要分布在表皮的棘层和皮脂腺细胞，可与FGF-10特异性结合［17］。KGFR/FGFR2b受体蛋白激活后可启动下游通路，即激活磷脂酶C-蛋白激酶C（PLC/PKC）通路，其主要诱导IL-1α生成及后续过度角化进程的发生。Melnik等［14］提出，过氧苯甲酰可以降解KGFR/FGFR2b受体，从而对KGFR/FGFR2b信号通路下游机制和效应发挥抑制作用。在本实验中，使用免疫荧光和免疫印迹法均证实了ALA-PDT在FGF-10诱导HaCaT细胞过度角化过程中可以减少KGFR蛋白的表达。我们认为ALA-PDT对角质形成细胞IL-1α分泌及细胞角化指标的作用与其抑制KGFR/FGFR2b信号通路密切相关。

综上所述，本研究证实，ALA-PDT可能通过KGFR/FGFR2b信号通路抑制FGF-10诱导的HaCaT细胞过度角化及增殖，这一机制的发现为解释ALA-PDT治疗非炎症性皮损现象提供理论依据，但仍需进一步的体内外研究予以深入研究。

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