外周血单一核细胞的体外活化对成纤维细胞增殖和基质金属蛋白酶产生的影响

康玉英 孙彩虹 鞠梅 陈崑 顾恒

胶原是皮肤组织细胞外结构中最丰富的成分，基质金属蛋白酶（MMP）是一组与胶原降解有关的酶，其中MMP-1、3、9这三种酶协同作用可完全降解皮肤胶原，被认为与光老化关系最为密切［1-2］。紫外线可诱导成纤维细胞表达或分泌MMP［3］，而对皮肤组织中炎症浸润细胞在光老化中的作用研究较少，仅发现肥大细胞、巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数目在曝光部位增多［4-5］。为进一步探讨炎症细胞是否直接或间接促进MMP增高或活性增加，我们对被活化的外周血单一核细胞（PBMC）及其活化产物刺激培养的成纤维细胞进行研究，探讨炎症细胞在光老化中的作用。

材料与方法

一、材料

1.标本来源：原代人皮肤成纤维细胞取自中国医学科学院皮肤病研究所儿童眼睑手术后皮肤组织，PBMC取自3例健康志愿者。本研究获中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会批准，患儿家长及所有志愿者均签署知情同意书。

2.主要试剂和仪器：鼠抗人MMP-1、MMP-3、MMP-9、白细胞介素（IL）-6 ELISA检测试剂盒为武汉USCN LIFE公司产品，RNA抽提试剂TRIzol（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），DL 2000 DNA标准参照物［宝生物工程（大连）有限公司］，植物血凝素（PHA）（上海伊华公司），兔抗人多克隆CD3抗体、CD28抗体（北京博奥森生物技术有限公司），噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司），RPMI 1640培养基、DMEM培养基（美国Gibco公司）。CO2孵箱（日本Espec公司），GeneAmp PCR System 2700（美国ABI公司），JS-380A自动凝胶图像分析仪（上海培清科技有限公司），Transwell培养板（美国Costar公司），DG-3022A酶联免疫检测仪（南京华东电子集团公司）。

二、方法

1.分离、活化 PBMC：参照文献［6-7］，无菌条件下采集健康志愿者新鲜抗凝外周血10 ml，于4 h内用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单一核细胞。接种至96孔培养板中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞至2×106/ml，分3组加入不同活化剂，使淋巴细胞活化：对照组不加活化剂，PHA组用含100 mg/L PHA刺激，双抗体组用含2 mg/L CD3及5mg/LCD28双抗体刺激，每孔终体积200μl。于37℃、相对湿度95%、5%CO2孵箱中培养72 h，收集上清液。

2.MTT法检测PBMC增殖活性：处理细胞、分组同上，每组设3个复孔，在培养（72 h）结束前4 h每孔加入MTT 20 μ（l5 g/L），继续培养4 h后弃去孔内培养基，加入 150 μl二甲基亚砜（DMSO），低速振荡10 min，酶联免疫检测仪550 nm处测定各孔A值。

3.酶联免疫吸附实验（ELISA）检测PBMC活化后上清液 IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋白含量：收集活化、培养72 h后PBMC的上清液，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔、阴性对照孔（RPMI 1640培养基），按照ELISA试剂盒说明书操作，450 nm处测定各孔A值。运用CurveExpert1.3软件绘制标准曲线及拟合方程，计算待测样品的含量。

4.半定量反转录（RT）-PCR法检测PBMC活化后MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA的表达：同上处理细胞、分组，每组10孔，培养24 h，收集PBMC，根据Trizol试剂说明书操作，提取总RNA，以β肌动蛋白基因为参照标准，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0设计，由生工生物工程（上海）服务有限公司合成。引物序列：β肌动蛋白正向引物5′-CACCTTCTACAATGAGCTGC-3′，反向 5′-AGGC AGCTCGTAGCTCTTCT-3′，扩增片段长度466 bp；MMP-1正向引物 5′-CTGAAGGTGATGAAGCAGC C-3′，反向 5′-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3′，扩增片段长度428 bp；MMP-3正向引物5′-CTCACAG ACCTGACTCGGTT-3′，反向 5′-C ACGCCTGAAGG AAGAGATG-3′，扩增片段长度 294 bp；MMP-9 正向引物 5′-CGCAGACATCGTCATCCAGT-3′，反向 5′-GGATTGGCCTTGGAAGATGA-3′，扩增片段长度406 bp。反转录反应参数42℃15 min、95℃5 min、4℃5 min。PCR反应参数：95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35个循环，72℃延伸7 min，4℃保存。取PCR扩增产物3 μl在15 g/L琼脂糖凝胶中（含0.5 mg/L溴化乙锭）电泳，于自动凝胶图像分析仪上扫描灰度值，以β肌动蛋白作内参，计算mRNA的相对表达水平。每组样本重复3次。

5.MTT法检测不同稀释度PBMC活化后上清液（即CM）对培养的成纤维细胞增殖活性的影响：同前方法分离、活化PBMC并收集CM，-20℃保存备用。参考文献［8］分离、培养人皮肤成纤维细胞，取第3～10代对数生长期人皮肤成纤维细胞，按5×104/ml密度接种至 96孔板，每孔100 μl，待细胞贴壁后（约10 h）分别加入不同体积的3组CM，分别为对照刺激组、双抗体刺激组、PHA刺激组，终体积为 200 μl，每组 CM 最终稀释度分别为 1/2、1/5、1/10、1/20，同时设不加CM组（对照组），共13组，每组设3个复孔。培养48h，培养结束前4h加入MTT20μl，同方法2测定各孔A值。

6.ELISA法检测不同稀释度CM对成纤维细胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白的影响：同方法5将成纤维细胞接种至96孔板，每孔100 μl，待细胞生长融合达90%时吸弃培养基，换用无血清DMEM培养基，过夜，吸弃培养基，加入无血清DMEM培养基及不同体积的3组CM，终体积为200 μl，CM最终稀释度分别为1/2、1/5、1/10，同时设不加CM组（对照组），共10组，每组设3个复孔，培养48h，收集上清液，最后同3组原液CM一起检测，共13组，同方法3用ELISA法检测各组细胞上清液中 MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白含量。

7.半定量RT-PCR法检测不同组CM对成纤维细胞表达MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA的影响：同方法5将成纤维细胞接种至6孔板，每孔3 ml，待细胞生长融合达90%时吸弃培养基，换用无血清DMEM培养基，过夜，吸弃培养基，加入2.4 ml无血清DMEM培养基及600 μl不同CM原液，同时设对照组加入无血清DMEM培养基3 ml，培养24 h，吸弃上清液，各孔加入TRIzol 1 ml，反复吹打，使细胞完全融解，根据Trizol试剂说明书操作，提取总RNA，同方法4检测成纤维细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 的相对表达水平。每组样本重复3次。

结 果

一、不同处理组PBMC的增殖活性及CM中IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋白含量比较

不同活化剂刺激PBMC后，PHA组、双抗体组、对照组之间 PBMC 增殖活性（A550）（F=8.507，P＜0.05）及上清液中 IL-6（F=5.692，P＜ 0.05）、MMP-3含量（F=6.098，P＜0.05）差异均有统计学意义。进一步两两比较，PHA组较对照组增殖活性及分泌IL-6、MMP-3水平明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。3组上清液中均未检测到MMP-1、MMP-9蛋白（A值为0.00至0.09不等）。

二、不同处理组 PBMC MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表达

活化剂刺激PBMC后可表达MMP-1 mRNA，但不表达MMP-3 mRNA（图1）或MMP-9 mRNA（图中未标出）。经Games-Howell检验两两比较，对照组、双抗体组、PHA组间PBMC表达MMP-1 mRNA水平差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

三、不同稀释度CM对成纤维细胞增殖活性的影响

单因素方差分析显示，1/2、1/5、1/10、1/20 CM 刺激后对照刺激组、双抗体刺激组、PHA刺激组、对照组组间成纤维细胞增殖活性（A值）比较，差异均无统计学意义；对照刺激组、双抗体刺激组、PHA刺激组各组内 1/2、1/5、1/10、1/20 CM 刺激后细胞增殖活性比较，差异均无统计学意义。见表2。

表1 不同处理组PBMC增殖活性（A550值）、上清液中IL-6和MMP-3含量、MMP-1 mRNA的相对表达水平（±s）

表1 不同处理组PBMC增殖活性（A550值）、上清液中IL-6和MMP-3含量、MMP-1 mRNA的相对表达水平（±s）

注：n=3。a：与对照组比较，P ＜ 0.05；b：与双抗体组比较，P ＜ 0.05。PBMC：外周血单一核细胞；IL：白细胞介素；MMP：基质金属蛋白酶

组别 增殖活性 I L-6（μ g/L） M M P-3（m g/L） M M P-1 m R N A对照组 0.3 7 0±0.0 5 6 0.9 8 6±0.1 0 7 6.5 6 7±2.1 2 2 0.0 8 3±0.0 1 6双抗体组 0.4 7 0±0.1 2 8 1.1 3 5±0.1 9 3 7.3 1 8±2.3 8 1 0.1 8 8±0.0 3 0 a植物血凝素组 0.6 5 0±0.0 4 4 a 1.5 7 3±0.3 8 4 a 1 2.6 7 0±2.4 8 5 a 0.7 1 4±0.1 0 4 ab

图1 不同处理组外周血单一核细胞基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-1 mRNA 表达结果 1、4、7：MMP-3（294 bp）；2、5、8：MMP-1（428 bp）；3、6、9：β肌动蛋白（466 bp）。1～3：双抗体刺激组；4～6：PHA刺激组；7～9：对照刺激组；10：阴性对照组；M：DNA标准参照物

表2 不同稀释度条件培养基（CM）刺激后成纤维细胞增殖活性（A550值，±s）

表2 不同稀释度条件培养基（CM）刺激后成纤维细胞增殖活性（A550值，±s）

注：n=3。同一稀释度下不同组间及同一组内不同稀释度间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）

C M稀释度组别F值 P值1/2 1/5 1/1 0 1/2 0对照组 0.2 7±0.0 2 5对照刺激组 0.2 7±0.0 3 6 0.2 8±0.0 1 2 0.2 6±0.0 1 0 0.2 5±0.0 1 5 0.7 3 0 ＞0.0 5双抗体刺激组 0.2 9±0.0 5 0 0.2 4±0.0 5 3 0.2 5±0.0 3 2 0.2 6±0.0 5 1 0.6 9 5 ＞0.0 5 P H A刺激组 0.2 4±0.0 1 5 0.2 4±0.0 2 6 0.2 4±0.0 5 5 0.2 6±0.0 3 2 0.2 2 0 ＞0.0 5 F值 1.3 8 1 0.9 8 7 0.4 1 4 0.0 8 8 P值 ＞0.0 5 ＞0.0 5 ＞0.0 5 ＞0.0 5

四、不同稀释度CM对成纤维细胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白的影响

不同稀释度CM刺激成纤维细胞后上清液中可检测到MMP-3蛋白，以原液CM中含量最高，1/10CM刺激时最低；在相同的稀释度刺激时，上清液中MMP-3含量以PHA刺激组最高，对照刺激组最低。经单因素方差分析，原液CM及1/5、1/10 CM刺激后对照刺激组、双抗体刺激组、PHA刺激组组间上清液中MMP-3含量差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），1/2 CM刺激后，3组间MMP-3含量差异无统计学意义（P＞0.05）；进一步两两比较显示，原液CM、1/10 CM时PHA刺激组较对照刺激组MMP-3水平明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），PHA刺激组与双抗体刺激组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；1/5 CM时PHA刺激组较对照刺激组、双抗体刺激组MMP-3水平均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；原液 CM、1/5 CM、1/10 CM时，对照刺激组与双抗体刺激组比较，MMP-3含量差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。而未受CM刺激的成纤维细胞上清液中未检测到MMP-3蛋白（A450值为0），不同稀释度CM刺激及未受CM刺激的成纤维细胞上清液中未检测到MMP-1或MMP-9蛋白（A450值为0.00至0.09不等）。

五、不同组CM对成纤维细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表达的影响

对照组及不同刺激组成纤维细胞MMP-1、MMP-3 mRNA均有表达（图2），4组间比较MMP-1、MMP-3 mRNA表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见表4。但各组均无MMP-9 mRNA表达。

表3 条件培养基（CM）原液以及不同稀释度CM刺激成纤维细胞后上清液中MMP-3含量比较（mg/L，± s）

表3 条件培养基（CM）原液以及不同稀释度CM刺激成纤维细胞后上清液中MMP-3含量比较（mg/L，± s）

注：n=3。a：与对照刺激组比较，P＜0.05；b：与双抗体刺激组比较，P＜0.05。MMP：基质金属蛋白酶

组别 C M 1/2 C M 1/5 C M 1/1 0 C M对照刺激组 6.2 4±2.0 0 3.0 5±0.8 0 1.1 1±0.4 6 0.4 0±0.1 2双抗体刺激组 6.7 9±1.9 8 4.0 7±1.8 9 1.2 8±0.3 6 0.6 0±0.0 0植物血凝素刺激组 1 2.1 2±2.6 2 a 8.7 8±3.7 6 2.5 6±0.1 7 ab 0.7 3±0.1 2 a F值 6.4 1 5 4.5 9 7 1 5.4 3 0 8.6 4 2 P值 ＜0.0 5 ＞0.0 5 ＜0.0 1 ＜0.0 5

图2 不同处理组成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA 表达检测结果 2、5、8、11：β 肌动蛋白（466 bp）；3、6、9、12：MMP-1（428 bp）；4、7、10、13：MMP-3（294 bp）。1：阴性对照；2 ～ 4：对照组；5～7：对照刺激组；8～10：植物血凝素（PHA）刺激组；11～13：双抗体刺激组；M：标准参照物

表4 不同处理组成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA的相对表达水平（±s）

表4 不同处理组成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA的相对表达水平（±s）

注：n=3。4组成纤维细胞MMP-1、MMP-3 mRNA表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05）

组别 M M P-1 m R N A M M P-3 m R N A对照组 1.1 3 6±0.0 8 8 0.9 9 1±0.3 1 4对照刺激组 0.9 7 8±0.1 3 0 1.0 0 3±0.2 0 6双抗体刺激组 0.9 4 7±0.2 6 4 0.8 8 8±0.1 2 7植物血凝素刺激组 1.2 3 1±0.2 2 3 0.9 6 3±0.0 8 4 F值 1.4 9 1 0.1 9 6 P值 ＞0.0 5 ＞0.0 5

讨 论

近年来炎症细胞在光老化中的作用逐渐受到研究者的关注。Bosset等［4］和 Hase 等［5］研究显示，皮肤组织中肥大细胞、巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数目在曝光部位增多，曝光部位皮肤MMP-1染色阳性的T淋巴细胞数显著增加。我们既往研究亦证实，曝光部位淋巴细胞、单核巨噬细胞数目显著高于非曝光部位，且淋巴细胞数增加与光照射累积相关［9］。有关炎症细胞在光老化中的作用机制以及对MMP影响的进一步研究显示，巨噬细胞可以分泌MMP-1［10］，肥大细胞能分泌激活MMP-1的蛋白酶［11］，T 淋巴细胞可表达 MMP-2、MMP-9、MMP-10、MMP-13（胶原酶 3）［12-14］。这些研究直接或间接证明炎症浸润细胞可分泌或激活某些MMP，参与光老化过程。

经典的PBMC活化剂包括PHA、刀豆素A等，为多克隆激活剂，不涉及抗原的特异性。而T淋巴细胞活化过程需要第一、二信号，涉及细胞表面抗原CD3、CD28的激活，近年以CD3、CD28抗体作为淋巴细胞激活剂的研究较多［15］。淋巴细胞活化后可分泌 IL-6、干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）等［16］，而 IL-1α、IL-6 等可诱导成纤维细胞分泌MMP-1、MMP-3［17-18］，考虑到 IL-6 作为淋巴细胞活化后产物可能参与诱导成纤维细胞分泌MMP，故将IL-6作为淋巴细胞活化的检测指标之一，但随后的淋巴细胞活化后产物（包含IL-6）刺激成纤维细胞实验未发现其显著的刺激作用，所以IL-6对MMP的刺激作用未作深入研究。

本研究分别以非特异性活化剂PHA及特异性活化剂CD3、CD28双抗体作为刺激剂，同时以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基作为对照，观察PBMC活化情况。MTT法检测PBMC增殖活性，发现PHA刺激组细胞活性最高，同时该组活化24 h后MMP-1 mRNA表达最高，活化后上清液中IL-6、MMP-3浓度亦最高，提示细胞增殖明显者MMP-1 mRNA表达水平及分泌IL-6、MMP-3水平高，而对照组细胞增殖活性、MMP-1 mRNA表达水平及分泌IL-6、MMP-3 水平最低，CD3、CD28 双抗体刺激组上述检测值介于二者之间，这与雷其洪等［19］对T淋巴细胞增殖转化的研究一致，即PHA刺激后细胞的增殖指数高于 CD3、CD28 抗体刺激者。Hase 等［5］发现，曝光部位皮肤MMP-1染色阳性的T淋巴细胞数显著增加，在一定条件下培养的T淋巴细胞表达MMP-1 mRNA，与我们的结果一致。但是在活化后上清液中各组均未检测到MMP-1蛋白，同样在培养的成纤维细胞上清液中亦未检测到MMP-1蛋白，但可检测到MMP-1 mRNA表达，可能为检测方法不当或灵敏度太低有关，确切原因有待进一步研究。

同时，我们在PBMC CM中可以检测到MMP-3蛋白，且浓度较高。采用不同稀释度的CM刺激成纤维细胞后其上清液中MMP-3蛋白含量随着CM的稀释而减少，且均低于原液CM。同时RPMI 1640培养基及不加CM的成纤维细胞上清液中均未检测到MMP-3蛋白，表明MMP-3为PBMC活化后产物，CM刺激成纤维细胞后上清液中MMP-3为CM中MMP-3稀释而非成纤维细胞分泌所致，而且CM刺激成纤维细胞后各组MMP-1、MMP-3 mRNA表达水平无显著性差异，表明CM对成纤维细胞的MMP-1、MMP-3 mRNA表达无影响，但不同刺激组PBMC活化后均未检测到MMP-3 mRNA表达。Fisher等［20］报道，紫外线照射人皮肤后 MMP-8 蛋白水平升高并伴随中性粒细胞浸润，但MMP-8 mRNA无表达，用糖皮质激素氯倍他索预处理可显著阻断该过程，表明紫外线照射使中性粒细胞脱颗粒释放预先存在的MMP-8蛋白，从而使皮肤中MMP-8蛋白水平升高，而不是新合成MMP-8。本研究中PBMC活化后上清液中可检测到MMP-3蛋白但无MMP-3 mRNA表达，是否与该研究中MMP-8升高的机理类似有待进一步深入研究。

有报道显示，对体外培养的成纤维细胞加入细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-10 后上清液中 MMP-1、-3、-9 浓度均增加［21］，将急性心肌梗死患者的PBMC体外培养24 h后MMP-9 mRNA表达及蛋白水平均增加2倍［22］。而我们在PBMC活化后上清液及培养的成纤维细胞上清液中均未检测到MMP-9蛋白，且在不加及加入 CM 24、36、48、72 h后均未检出，同时在MMP-9 mRNA表达实验中对不同的PCR引物、退火温度进行了摸索，但MMP-9 mRNA表达均为阴性（因结果阴性未列出），是否为刺激条件、实验方法等不同导致MMP-9在培养的PBMC、成纤维细胞中表达阴性仍需进一步研究。

本研究对PBMC进行体外活化，可检测到MMP-3蛋白及MMP-1 mRNA表达，但PBMC活化后上清液不能刺激成纤维细胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋 白 及 表 达 MMP-1、MMP-3 mRNA，表明炎症细胞可能通过自身产生MMP而不是作用于成纤维细胞发挥作用。我们的研究显示，PBMC体外活化后可以表达MMP-1 mRNA及分泌MMP-3蛋白，下一步我们将使用紫外线照射PBMC，以观察紫外线照射下PBMC的活化、MMP表达等情况，进一步明确炎症浸润细胞在光老化中的作用以及分子机制。

［1］Fisher GJ,Datta SC,Talwar HS,et al.Molecular basis of suninduced premature skin ageing and retinoid antagonism［J］.Nature,1996,379（6563）:335-339.

［2］Fisher GJ,Wang ZQ,Datta SC,et al.Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light［J］.N Engl J Med,1997,337（20）:1419-1428.

［3］Scharffetter K,Wlaschek M,Hogg A,et al.UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblastsin vitroandin vivo［J］.Arch Dermatol Res,1991,283（8）:506-511.

［4］Bosset S,Bonnet-Duquennoy M,Barré P,et al.Photoageing shows histological features of chronic skin inflammation without clinical and molecular abnormalities ［J］.Br J Dermatol,2003,149（4）:826-835.

［5］Hase T,Shinta K,Murase T,et al.Histological increase in inflammatory infiltrate in sun-exposed skin of female subjects:the possibleinvolvement of matrix metalloproteinase-1 produced by inflammatory infiltrate on collagen degradation ［J］.Br J Dermatol,2000,142（2）:267-273.

［6］徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学 ［M］.2版.北京:人民卫生出版社,1991:1214-1215.

［7］骆群,吕明,于鸣,等.抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达［J］.中国实验血液学杂志,2006,14（3）:547-551.

［8］赵娟,石艳,孙波,等.人皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定［J］.吉林大学学报（医学版）,2008,34（5）:899-902.

［9］康玉英,鞠梅,陈旭,等.炎症浸润细胞在曝光和非曝光部位皮肤中的组织学表现［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（7）:476-478.

［10］Welgus HG,Campbell EJ,Cury JD,et al.Neutral metalloproteinases produced by human mononuclear phagocytes.Enzyme profile,regulation,and expression during cellular development［J］.J Clin Invest,1990,86（5）:1496-1502.

［11］Suzuki K,Lees M,Newlands GF,et al.Activation of precursors for matrix metalloproteinases 1 （interstitial collagenase） and 3（stromelysin）by rat mast-cell proteinases I and II［J］.Biochem J,1995,305（Pt 1）:301-306.

［12］Romanic AM,Madri JA.The induction of 72-kD gelatinase in T cells upon adhesion to endothelial cells is VCAM-1 dependent［J］.J Cell Biol,1994,125（5）:1165-1178.

［13］Weeks BS,Schnaper HW,Handy M,et al.Human T lymphocytes synthesize the 92 kDa type IV collagenase （gelatinase B）［J］.J Cell Physiol,1993,157（3）:644-649.

［14］Willmroth F,Peter HH,Conca W.A matrix metalloproteinase gene expressed in human T lymphocytes is identical with collagenase 3 frombreastcarcinomas［J］.Immunobiology,1998,198（4）:375-384.

［15］Garlie NK,LeFever AV,Siebenlist RE,et al.T cells coactivated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potential immunotherapy for cancer［J］.J Immunother,1999,22（4）:336-345.

［16］ Mikko M,Fredriksson K,Wahlström J,et al.Human T cells stimulate fibroblast-mediated degradation of extracellular matrixin vitro［J］.Clin Exp Immunol,2008,151（2）:317-325.

［17］Fagot D,Asselineau D,Bernerd F.Direct role of human dermal fibroblasts and indirect participation of epidermal keratinocytes in MMP-1 production after UV-B irradiation［J］.Arch Dermatol Res,2002,293（11）:576-583.

［18］夏济平,宋秀祖,毕志刚.紫外线对皮肤角质形成细胞和成纤维细胞产生MMP-1和MMP-3的影响［J］.中国麻风皮肤病杂志,2006,22（1）:11-13.

［19］雷其洪,吴健民.CD28单克隆抗体共刺激检测T细胞功能［J］.中华检验医学杂志,2000,23（4）:226.

［20］Fisher GJ,Choi HC,Bata-Csorgo Z,et al.Ultraviolet irradiation increases matrix metalloproteinase-8 protein in human skinin vivo［J］.J Invest Dermatol,2001,117（2）:219-226.

［21］Wong WR,Kossodo S,Kochevar IE.Influence of cytokines on matrix metalloproteinases produced by fibroblasts cultured in monolayer andcollagen gels［J］.J Formos Med Assoc,2001,100（6）:377-382.

［22］Fang L,Du XJ,Gao XM,et al.Activation of peripheral blood mononuclear cells and extracellular matrix and inflammatory gene profile in acute myocardial infarction［J］.Clin Sci（Lond）,2010,119（4）:175-183.