雌激素质谱筛查分析方法的研究

■史艳艳 刘庆生 范志影 李 俊 秦玉昌

（1.天津市兽药饲料监察所，天津 300402；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；3.农业部食物与营养发展研究所，北京 100081）

饲料中添加激素类物质可以促进家畜的生产力，降低动物死亡率，缩短动物饲养周期，促进动物性产品产量的增长，具有稳定的增产效果。这些雌性激素在人体内富集会造成人体内分泌紊乱，儿童受到的危害尤其大。常见的雌性激素有雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚和染料木素等多种，其中染料木素属植物雌激素。建立上述8种雌激素简便高效的分析方法是非常必要而且有意义的工作。

根据文献报道，己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚等的雌激素分析方法主要分为HPLC法[1]、GC-MS法[2]、荧光法[3]、LC-MS/MS法[4-6]、酶联免疫分析法（ELISA）[7-8]等。其中HPLC法的灵敏度较低、排除干扰能力差，难以满足低残留限量的检测要求；GC-MS法需要衍生，前处理过程繁琐，并且衍生效率对结果的准确度影响大；酶联免疫分析法灵敏度高，但难以对多组分化合物进行同时测定；LC-MS/MS抗背景干扰能力强，分辨率较高、灵敏度高、选择性好，常用于痕量检测，并且同时具备定性定量能力。常见的激素或抗生素多以液相色谱-质谱联用技术分析，采用除色谱保留时间外，两次选择（MRM模式）有效排除色谱同流出物质，并且同一方法中可同时实现多种（＞100种）化合物的分析。液相色谱-质谱联用技术是目前有毒有害物质，包括雌性激素在内的化合物的常见分析方法。但针对雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚和染料木素等8种化合物同时检测的LC-MS/MS定性法尚未见报道。本文着力于建立一种样品前处理简单、灵敏度高、适用范围广且能够同时检测上述8种雌激素类的方法。

1 实验部分

1.1 仪器和设备

Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色谱仪(日本岛津公司)、API 3200质谱仪（AB SCIEX公司）、超声波水浴（宁波海曙超声仪器公司）、AB204-E型电子分析天平（METTLER公司）、RH2000离心机（湖北湘宜有限公司）、涡旋振荡器（美国IKA公司）、纯水仪（美国密立博公司）。

1.2 试剂与药品

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸铵（色谱纯）、氯化钠（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、正己烷（分析纯）、乙酸（分析纯）、雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚：纯度＞98%，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。染料木素：纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：KA0412CB13。

1.3 标准溶液的制备

标准品用少量乙腈溶解，色谱纯乙腈定容配制1 mg/ml标准储备液，混合均匀后密封冷冻保存。根据需要将标准储备液稀释至1 μg/ml标准工作液，4℃下保存，使用前纯水稀释一系列浓度的标准溶液。

1.4 仪器参数

1.4.1 质谱条件

利用电喷雾离子源（ESI），采用MRM多反应监测。负离子模式下（ESI-）：喷雾电压（IS）-3 500 V，雾化气（GS1）40 ml/min，气帘气（CUR）30 ml/min，辅助加热气（GS2）65 L/min，离子源温度（TEM）550℃，碰撞气6 ml/min，4种气体均为氮气；Q1和Q3均为单位分辨率；正离子模式下(ESI+)：喷雾电压(IS)+5 000 V，雾化气（GS1）55 ml/min，气帘气（CUR）20 ml/min，辅助加热气（GS2）65 L/min，离子源温度（TEM）550℃，碰撞气6 ml/min，4种气体均为氮气；Q1和Q3均为单位分辨率。8种雌激素的质谱优化条件见表1。

表1 MRM监测模式下8种雌激素的质谱优化条件

1.4.2 色谱条件

色谱柱：Kinetex2.6 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；进样量：20 μl；流动相A为乙腈，流动相B为5 mM乙酸铵溶液，进行梯度洗脱。梯度洗脱：0～2 min，维持20%A；2～4 min，20%A线性变化至60%A；4～5 min，60%A线性变化至70%A；5～6 min，70%A线性变化至95%A；6～6.1 min，维持95%A；6.1～8 min，维持20%A。

1.5 样品处理

称取1.0 g（精确至0.001 g）饲料样品，置于50 ml具塞塑料离心管中，加入2 ml蒸馏水，待饲料浸润后再加入18 ml甲醇，涡旋混匀1 min，振荡10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液，加入20 ml正己烷，涡旋，振荡10 min，10 000 r/min离心5 min，取下层液体，旋转蒸发溶剂，蒸干后用20%乙腈水溶液2 ml溶剂，过0.2 μm滤膜，上机分析[9-10]。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化选择

2.1.1 质谱条件的优化

为获得最佳的电离方式，采用流动注射泵连续进样方式进行质谱条件的优化，分别将上述8种雌激素于正、负离子模式下进行全扫描，以选择适当的电离方式和分子离子峰。结果表明雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、己烯雌酚和己二烯雌酚在负离子[M-H]-模式下响应值高，苯甲酸雌二醇和染料木素在正离子[M+H]+模式下响应强度最高。根据欧盟2002/657/EC指令[11]规定，于质谱验证方法必须达到4个验证点的要求，在确定母离子的基础上选择两个或两个以上子离子。在确定上述8种雌激素的母离子后，采用子离子扫描对子离子进行优化选择，通过优化离子源参数以及去簇电压、出口电压、碰撞能量等质谱参数，使每种雌激素的离子化效果达到最佳。

2.1.2 色谱条件的优化

2.1.2.1 色谱柱的选择

选择实验室已有Kinetex2.6 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Dionex Aalaim120 C18（3 mm×150 mm，3 μm）、Agilent XDB-C18（3 mm×100 mm，3.5 μm）、Phoenix Luna C18（2.0 mm×150 mm，3 μm）4种色谱柱，按照相同梯度、相同浓度采集样品，得到不同的分离度及信号响应。

通过对比，4种色谱柱中Kinetex C18信号响应最高（见图1），峰型尖锐，峰型较对称，且出峰速度快，节省溶剂。因此本研究采用Kinetex C18作为分离柱。

图1 Kinetex C18柱负离子模式下6种化合物信号响应

2.1.2.2 流动相的选择

将8种雌激素在同一方法中进行分析，不在有机相中添加甲酸、乙酸等酸性或氨水等增强电离的化合物，只能选择甲醇、乙腈等常规溶剂配合甲酸铵或乙酸铵使用。一般地，乙腈和甲醇均可作为洗脱液，本研究根据实验习惯，选择乙腈作为洗脱液。在相同含量下，5 mM甲酸铵和5 mM乙酸铵进行对比，使用5 mM乙酸铵时信号略强，整体无太大差距，本研究根据实验室检测习惯，使用乙酸铵增强电离能力。

通过选择不同的液相梯度，得到不同的保留时间和信号强度，分别按照不同初始有机相比例和有机相变化速度设定不同的方法，详细数据见表2。

表2 不同初始有机相比例流动相列表

随着初始有机相比例的降低，色谱峰分离效果越好，保留时间略微偏后，灵敏度增加较为明显。初始的有机相比例低，色谱柱保留效果好，对应的分离度增加。图2中可见，设置条件c时，色谱峰峰型尖锐，分离度好且响应值最高，此时流动相比例最为合理。由表2可知，采用初始有机相比例20%，保持2.0 min，随后增加有机相比例，在4.0 min时达到60%；继续增加有机相比例，在5.0 min时达到70%；继续增加到5.1 min时设置95%；稳定1 min；6.1 min降为20%，维持2.0 min结束。因此，选择乙腈和5 mM乙酸铵作为流动相进行梯度洗脱。

图2 c流动相条件下的色谱图

2.2 样品前处理的选择

仪器方法优化成功后，筛选前处理方法。文中采用典型的几种提取、净化方法用于处理饲料及其相关产品，利用空白基质加标分别添加相当于10 ng/ml标准溶液到饲料和生鲜乳中，以期得到一种简单快速、环境友好的实验方法。

2.2.1 乙腈提取法

称取1.0 g（精确至0.001 g）样品，置于50 ml具塞塑料离心管中，添加10 ml乙腈，涡旋混合均匀后超声波提取15 min，离心机高速离心，过0.2 μm滤膜，上机分析。

2.2.2 液液萃取法

称取1.0 g（精确至0.001 g）饲料样品，置于50 ml具塞塑料离心管中，加入2 ml蒸馏水，待饲料浸润后再加入18 ml甲醇，涡旋混匀1 min，振荡10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液，加入20 ml正己烷，涡旋，振荡10 min，10 000 r/min离心5 min，取下层液体，旋转蒸发溶剂，蒸干后用20%乙腈水溶液2 ml溶剂，过0.2 μm滤膜，上机分析。

2.2.3 固相萃取法

称取1.0 g（精确至0.001 g）样品，置于50 ml具塞塑料离心管中，加入pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液10 ml、酶解液50 μl，于37℃水浴振荡器中酶解12 h后取出，冷却至室温，加入20 ml甲醇超声提取15 min，10 000 r/min离心10 min，上清液转入100 ml鸡心瓶中，残渣再以15 ml甲醇提取1次，10 000 r/min离心10 min，合并2次的上清液。向上清液中加入10 ml正丙醇，于45℃旋转蒸发至残液基本为水时(约10 ml)，加入1 ml甲醇超声混匀后上LC-C18固相萃取柱，并以适量体积分数的10%甲醇水溶液洗涤鸡心瓶，洗涤液一并上LC-C18固相萃取柱。以5 ml 10%的甲醇溶液淋洗后抽至近干，下端接已用5 ml甲醇活化的LC-NH2柱，以8 ml 90%的甲醇洗脱。洗脱液于50℃下N2吹干，加入1 ml 80%的甲醇溶液，旋涡混匀1 min，超声2 min溶解，过0.2 μm滤膜，上机分析。

对比上述三种前处理方法，得到的结果见表3。从结果中看出，回收率最好的为液液萃取法，其次为乙腈提取法，而固相萃取法回收率最差。实际固相萃取法回收率虽然不高，但是净化效果好，得到的上机液较为纯净，分析结果受基质影响小。由于固相萃取法操作复杂，容易在分析过程中，因为步骤繁琐导致人为错误进而影响分析结果。所以在实验中，优先采用液液萃取法前处理方法。

表3 前处理回收率（%）

2.3 标准曲线及重现性

2.3.1 标准曲线

逐步稀释8种雌激素标准溶液，得到一系列浓度，逐个采集数据，每个浓度重复3次。分别稀释到0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng等12个梯度，采集数据后，按照1/X2权重计算，浓度与峰面积归一计算法，采集MRM数据外标法定量，得到8种雌激素的校正曲线。数据表明，8种雌激素在0.5～50 ng/ml范围内有良好的线性关系，相关系数R2＞0.99。这里以雌二醇和苯甲酸雌二醇为例（见图3），展示校正曲线范围和线性。

图3 雌二醇标准曲线

2.3.2 重现性实验

分别选取苜蓿和生鲜乳作为基质，验证方法准确性。取空白基质添加0.05、0.5、1.0 μg/kg 3个添加水平上（见图4和图5），每个水平重复5次得到的平均回收率在67.2%～103.4%之间（见表4），相对标准偏差在0.39%～5.97%之间（见表5）。除雌三醇外，表4中展示的重现性基本满足实验室80%～120%的需求。表5中展示相对标准偏差的数据，可见重现性良好，实验结果准确度高，适合实验室日常定量检测。

图4 生鲜乳中添加8种雌激素负离子模式总离子流图

图5 苜蓿中添加8种雌激素正离子模式总离子流图

表4 不同添加水平下不同雌激素的回收率（%）

表5 不同添加水平下不同雌激素的重现性（%）

2.4 灵敏度（见图6）

图6 部分化合物在0.1 ng/ml时的S/N

逐步稀释雌激素的上机浓度达到最低检出限，按照S/N＞3计算，8种雌激素在0.005 ng/ml时接近LOD，设定为8种雌激素的最低检出限。按照S/N＞10计算，8种雌激素最低定量下限为0.01 ng/ml。图6中展示部分化合物根据国家标准要求最低检出限0.1 ng/ml时的S/N。

实验数据表明，以上分析方法得到的灵敏度非常高，能够满足分析饲料类样品的灵敏度要求。

3 结论

本研究通过对仪器的质谱条件和色谱条件的优化，以及样品前处理方法的选择，建立了雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚、己二烯雌酚和染料木素等8种激素的多残留高效液相色谱-串联质谱的分析方法，用生鲜乳和苜蓿验证检测，得出该方法分析时间短，重现性好，实验结果准确度高，检出限低，节约成本，提高了检测效率。该分析方法可用于对生鲜乳和饲料中激素类物质的摸底排查。