肉鸭消化道酵母益生菌热胁迫耐受性及其机理研究

■彭思源 王学东 李 彪 胡先勤龚阿琼 郑红生 何林玲

（1.武汉轻工大学，湖北武汉 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武汉永生鸭业有限公司，湖北武汉 430077）

从微生物防控角度预防疾病，利用有益菌治疗致病菌的原理控制预防疾病的发生，从而减少养殖环节的用药是其中最关键一环。热休克蛋白（Hot shock protein，Hsp）通常被称为应激蛋白或蛋白分子伴侣[1]。它是一切有生命细胞遇短暂高温、缺氧、亚砷酸盐及H2O2等应激原刺激时所发生的一种以基因表达和调控变化为特征的细胞应激反应[2]。根据Hsp的相对分子质量，主要的Hsp被分成6个家族：大分子量Hsp家族、Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族、小分子量Hsp家族和泛素[3-4]。其中热激蛋白的累积与细胞耐热性的提高具有密切相关性，如Lindquist等[5]发现细胞内大量表达的Hsp104对酵母的耐热性大大提高具有积极作用。Hsp70的细胞保护作用是指机体细胞在收到各种应激、如高温，氧化等有害应激时，产生的Hsp70可以增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常功能代谢，提高细胞生存率[6]。几乎所有的细胞均能合成热休克蛋白，其中Hsp70家族含量最多亦最重要。目前认为Hsp70具有多种功能，是一种非特异性细胞保护蛋白，因此备受关注[2]。本试验旨在从肉鸭消化道内分离筛选出5株酿酒酵母中，通过热激处理选取最有高抗性的菌株，并探究温度与酵母菌株胞内热休克蛋白的相关性，本研究为开发高抗性、专一型的酵母益生菌制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本实验室从肉鸭肠道分离保存的5株酿酒酵母。

1.1.2 培养基

琼脂培养基、YPD培养基均为国产。

1.1.3 试剂

0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8、10%SDS(BIOSHARP)、0.1%溴酚蓝（BIOSHARP）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（BEYOTIME）、marker(THERMO)、0.25%考马斯亮蓝R-250（BIOSHARP）;β-巯基乙醇、甘油等均为国产。

1.1.4 仪器设备（公司名称）

单人单面净化工作台（SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司）、恒温恒湿培养箱（LRHS-150-Ⅱ，上海跃进医疗器械有限公司）、恒温培养振荡器（HNY-200B，天津市欧诺仪器仪表有限公司）、手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（YX280A，上海三申医疗器械有限公司）、高压均质机（AH-2010，ATS Engineering Limited）、电泳仪（PowerPac，BIO-RAD）、凝胶成像仪（Gel DocTMEZ，BIO-RAD）、离心机（TDZ5-WS，平凡仪器）、超声波仪（UWave-1000，新仪）、超纯水系统（Milli-Q Intergral，美国Millipore密理博）、医用低温保存箱（DW-40L188，青岛海尔特种电器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌的培养

将5株酿酒酵母分别接种于YPD培养基中，28℃、160 r/min 2次培养（以获得第二代酵母细胞）至对数期（107～108个/ml）[7]。

1.2.2 酵母菌超声波法破壁[8]

称取适量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3，制成酵母悬液，设定功率300 W，于冰浴条件下进行超声破碎30 min（设定工作5 s，间隔10 s）。

1.2.3 酵母菌冻融法破壁[8]

称取适量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3制成酵母悬液，分别于-20℃冰箱中反复冻融3～5次，每次冷冻时间2 h，100℃水浴中解冻20 min。

1.2.4 酵母菌高压均质机破壁

称取适量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3制成酵母悬液[9]，均质压力调整为140 MPa，经2～3次循环。

1.2.5 酵母菌染色

用吕氏碱性美兰进行染色，破壁的酵母呈兰紫色，而未破壁的酵母呈无色透明，分别计数，并采用相同的稀释度用血球记数板进行镜检记数。计算破壁率。破壁率的计算公式：

式中：α——破壁率（%）；

c——破壁前的细胞数（相同稀释倍数）；

c'——破壁后的细胞数（相同稀释倍数）；

n1——染色后呈无色透明细胞数；

n2——染色后呈兰紫色细胞数。

1.2.6 酵母热休克处理及电泳样品制备

根据现有文献报道基础上做了适当的分析[10]，选择30、37、42、45、48℃和50℃温度梯度对酿酒酵母菌进行热激诱导处理30 min。4 000 r/min离心5 min收集菌体，用超纯水洗涤三次。按料液比1∶3加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，调节高压均质机140 MPa作用3次。加入数滴巯基乙醇、甘油、10%SDS、溴酚蓝。

1.2.7 凝胶电泳的制备

测定蛋白质分子量需进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据文献[11]进行料液配比。分离胶浓度为8%，浓缩胶浓度为5%，染色液为0.25%考马斯亮蓝R-250溶液，脱色液为10%无水乙醇和10%乙酸溶液。

2 结果和分析

2.1 不同破壁方法的破壁率（见表1）

表1 冻融法、超声波法、高压均质机破壁率(%)

酿酒酵母在冻融法、超声波法和高压均质法等三种方法处理后，测定其破壁率，发现运用高压均质法破壁效果最好。当进行3次均质、原菌液稀释102时，菌株的破壁率达到94.54%。同时高压均质机在物理方法处理细胞壁中能有效地控制温度对细胞和热休克蛋白的活性。本试验方法简单，便于后续试验的操作。

2.2 菌株热击处理后的蛋白变化

5株酿酒酵母在不同温度下用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒提取热处理破壁后酿酒酵母菌中分泌的热休克蛋白(结果见图1～图5)。

图1 1号菌株不同温度进行热激处理

图2 2号菌株不同温度进行热激处理

图3 3号菌株不同温度进行热激处理

图4 4号菌株不同温度进行热激处理

图5 5号菌株不同温度进行热激处理

从图中可以看出，5株酿酒酵母在热激处理后新出现了2种清晰的蛋白条带，或部分原有蛋白表达量增加了，分子量分别位于70 kD和90 kD附近，推测其可能为热休克70家族和热休克90家族；另一方面，热休克应答后，许多蛋白条带颜色变浅，表面在热休克过程中，酵母减少了一些正常蛋白的合成。

2.3 热休克应答内参法蛋白图谱比较

5株酿酒酵母分别提取胞内蛋白质进行SDSPAGE电泳（见图1～5），在此基础上使用IMAGE LAB调整体积进行分析获得折线图（见图6～10）。

3 讨论

3.1 不同破壁效果的差异

对酵母进行高效的破壁处理，是保障后期蛋白质SDS-PAGE电泳质量的前提条件。不同破壁方法有各自的优缺点（如表2）。

图6 1号菌株不同温度内参法比较

图7 2号菌株不同温度进行热激处理

图8 3号菌株不同温度进行热激处理

图9 4号菌株不同温度进行热激处理

图10 5号菌株不同温度进行热激处理

本研究高压均质处理，酵母的破壁率明显高于冻融法和超声波法。究其原因，这是由于高压均质可破坏酵母细胞的结构，消除底物和酵母内源酶的空间位阻，从而加速酵母细胞的自溶，有利于蛋白质RNA等大分子物质的降解[9]。在一定范围内，均值压力越高对酵母破壁越有利，但综合设备均值压力的限制和操作能耗等因素，均质压力并不是越高越好，应当有一个最佳值[12]。本试验中，在140 MPa压力下，经2～3次循环，即可获得良好的破壁率。

3.2 热应激蛋白与温度的相关性

有研究表明，机体在高温等不良环境中会自发产生热休克应答反应来保护自己[13]。酵母在热休克应答过程中，能极快地诱导产生一组特殊的蛋白质——热休克蛋白（HSP）[14]，细胞耐热性的增强同热激蛋白的累积密切相关[15]。从图1～图5可以看出在30℃下目标蛋白不够清晰，37℃之后逐渐清晰，42℃后条带表达量对比值达到最大分泌，到达最高值。之后虽然还存在目标蛋白但表达量不够,逐渐减少。根据图6～图10知道第3株菌株的耐热性相对于其他菌株而言更好，它在45、48℃的表现比其他4株更为明显。

表2 冻融法、超声波法、高压均质法原理及优缺点

酵母菌具有十分复杂的耐热机制，该机制与细胞内多个生理过程的改变有着密切关联，维持细胞内部结构稳定性的过程，包括诱导表达热激蛋白的过程[16]，重构代谢过程等[17-18]。本试验酿酒酵母热击后新出现了2种清晰的蛋白条带，经目前HSP的分类系统[19]比较后应属于热休克蛋白70家族和热休克蛋白90家族。但并不是所有菌株都明显出现热休克90家族。

对于未来研发高抗性酵母益生菌制剂及代替抗生素，成为一种安全的生物制剂。对于动物消化道菌落具有调节作用，后期也可加入饲料中，增强其耐受性。

4 结论

肉鸭消化道酵母菌株的耐热性存在差异，不同菌株的耐热性与热休克蛋白70家族和90家族的表达密切相关。研究试验菌株中3号菌株的热应激耐受性最佳，可以作为后续肉鸭专用饲用酵母益生菌的备选菌株，为开发高抗性、专一型的酵母益生菌制剂奠定基础。